陳世明，董文心，章瑾，宣丹英，顧豐華，毛鐘鳴，陳婕美，陳嘉，劉翔，陳鵬翾，趙燁

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種發(fā)生在中老年期常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能（dopamine，DA）神經(jīng)元變性壞死和紋狀體區(qū)多巴胺能神經(jīng)元水平減少為主要病理特點(diǎn)[1]。目前臨床上的治療方法都只能改善癥狀，無(wú)法阻止病情的發(fā)展。因此一些細(xì)胞移植的創(chuàng)新療法成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)[2-3]。

人神經(jīng)干細(xì)胞（human neural stem cells，hNSCs）存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，是一類具有自我更新復(fù)制，能分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞[4-5]。神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)，移植到病人體內(nèi)，向神經(jīng)系統(tǒng)病變部位趨行、聚集，并存活、增殖、分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，從根本上補(bǔ)充缺失和缺損的多巴胺能神經(jīng)元，成為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的新方法[6-7]。但由于技術(shù)原因，神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)存在易分化和易死亡的技術(shù)難題[8-9]，目前獲取途徑主要是從胚胎或流產(chǎn)胎兒中分離并進(jìn)行有限的擴(kuò)增培養(yǎng)，這樣的神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源混雜，無(wú)法達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化，且存在著倫理問(wèn)題。因而如何確保神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)源穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)、用之不竭成為臨床治療帕金森病的關(guān)鍵[10-11]。本研究從流產(chǎn)胎兒中分離神經(jīng)干細(xì)胞，在體外長(zhǎng)期規(guī)?；囵B(yǎng)和擴(kuò)增，并探討是否能改善帕金森模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為及其移植后腦內(nèi)存活和分化情況，解決臨床上人神經(jīng)干細(xì)胞治療帕金森病細(xì)胞來(lái)源困難這一關(guān)鍵問(wèn)題。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F-12（1∶1）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；重組人表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhEGF）、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhbFGF）、N2 神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑、B27、胰酶（TP-EDTA）均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；水合氯醛、抗壞血酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 Wistar 大鼠 120只，體重約 300 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：2007000535474。在二級(jí)清潔級(jí)大鼠飼養(yǎng)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 PD 大鼠模型的建立 110 只大鼠經(jīng)反復(fù)行為檢測(cè)確認(rèn)其無(wú)旋轉(zhuǎn)行為。腹腔注射 12% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，將大鼠固定于三維腦立體定向儀上。手術(shù)區(qū)域皮膚消毒，皮正中切口，暴露前囟，使用微量注射器將 6-OHDA 分兩點(diǎn)（每點(diǎn) 2 μg/4 μl）注射進(jìn)入腦內(nèi)黑質(zhì)致密體部位（參照Paxinos 和 Watson 鼠腦立體定位圖譜）。注射位點(diǎn)：第 1 點(diǎn)：前囟后 5.2 mm，旁開(kāi) 2.2 mm，顱骨下 8.3 mm（黑質(zhì)-致密體部）；第 2 點(diǎn)：前囟后5.2 mm，旁開(kāi) 2.2 mm，顱骨下 7.8 mm（黑質(zhì)-網(wǎng)狀-背內(nèi)側(cè)層）。術(shù)畢，大鼠連續(xù) 5 d 肌肉注射青霉素以防感染，并單只單籠飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。于術(shù)后7、15、22 及 30 d 分別腹腔注射阿撲嗎啡誘發(fā)大鼠向健側(cè)單向旋轉(zhuǎn)，并進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè)。計(jì)數(shù)30 min，以旋轉(zhuǎn)圈數(shù) ＞ 7 次/min 的大鼠作為成功模型。

1.2.2 細(xì)胞移植 根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]連續(xù)培養(yǎng)12 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞球，加 0.25% TP-EDTA 消化液消化，離心，棄上清液，加 DMEM/F-12 重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)；取神經(jīng)分化細(xì)胞，加 0.25% TP-EDTA 消化液消化，離心，棄上清液，加 DMEM/F-12 重懸細(xì)胞計(jì)數(shù)。

將 PD 成功模型大鼠隨機(jī)分為 NSC 高劑量組（細(xì)胞濃度為 1.0 × 107/ml）、NSC 低劑量組（細(xì)胞濃度為 0.2 × 107/ml）、NSC 混合組（0.2 × 107/ml的神經(jīng)干細(xì)胞 + 1.0 × 106/ml 的神經(jīng)分化細(xì)胞）和生理鹽水對(duì)照組。PD 模型大鼠在移植前 1 d進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測(cè)試，并經(jīng)口灌胃給予大鼠環(huán)孢菌素（10 mg/kg），連續(xù)給藥 3 d。PD 模型大鼠經(jīng)腹腔注射 12% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，將大鼠固定于三維腦立體定向儀上。手術(shù)區(qū)域皮膚消毒，皮正中切口，暴露前囟，使用微量注射器將人神經(jīng)干細(xì)胞分 2 點(diǎn)（每點(diǎn) 4 μl）注射進(jìn)入腦內(nèi)紋狀體部位。第 1 點(diǎn)：前囟前 1.0 mm，旁開(kāi) 2.5 mm，顱骨下 4.5 mm；第 2 點(diǎn)：前囟前 1.0 mm，旁開(kāi)2.5 mm，顱骨下 5.5 mm。術(shù)畢大鼠連續(xù) 5 d 肌肉注射青霉素以防感染。對(duì)照組大鼠采用相同于治療組的操作方法，在紋狀體相應(yīng)靶點(diǎn)注射等劑量的生理鹽水。

1.2.3 行為學(xué)檢測(cè) 神經(jīng)干細(xì)胞移植 10 d 后，對(duì)每只大鼠進(jìn)行旋轉(zhuǎn)測(cè)試，計(jì)數(shù) 30 min。此后 3 個(gè)月內(nèi)，第 2、4、5、6、8、9 周各計(jì)數(shù) 1 次，共計(jì)數(shù) 6 次。

1.2.4 腦組織切片染色 大鼠以 12% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，頸部手術(shù)區(qū)域剃毛消毒。頸部正中切口，分離一側(cè)頸部總動(dòng)脈并插管，經(jīng)插管向腦部灌流 4% 多聚甲醛溶液，斷頭取腦。用4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次5 min；0.3% TritonX-100 作用 20 min，PBS 洗3 次，每次 5 min；10% 羊血清封閉 50 min，吸棄多余血清，加 MAP-2 一抗，4 ℃ 濕盒孵育過(guò)夜，PBS 洗 3 次，每次 5 min；滴加二抗（熒光標(biāo)記），室溫 50 ～ 60 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；甘油封片。倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 Statistica 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)移植組和對(duì)照組的組內(nèi)及組間旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組內(nèi)、組間均采用t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD 大鼠模型的建立

造模后大鼠存活率為 75.5%。1 個(gè)月后做旋轉(zhuǎn)測(cè)試，存活大鼠造模成功率為 39.8%。模型成功鼠腦組織切片證實(shí)大鼠注藥側(cè)黑質(zhì)紋狀體區(qū)神經(jīng)元染色明顯減少，有 PD 特征性改變（圖 1）。說(shuō)明通過(guò)該方法建立的大鼠 PD 模型較穩(wěn)定，可進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)。

圖 1 健康大鼠黑質(zhì)部位（A）和模型大鼠 6-OHDA 毀損側(cè)黑質(zhì)部神經(jīng)（B）Figure 1 Substantia nigra neurons of healthy rat (A) and substantia nigra neurons was damaged by 6-OHDA (B)

圖 2 PD 模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的改變情況Figure 2 Changes of rotational behavior-induced by apomorphine in PD model rats in four groups

圖 3 模型大鼠干細(xì)胞紋狀體移植側(cè)神經(jīng)元（A：× 40；B：× 100；C：× 200）Figure 3 Substantia nigra neurons after the cell transplantation (A: × 40；B: × 100；C: × 200)

2.2 神經(jīng)干細(xì)胞移植

神經(jīng)干細(xì)胞移植 3 個(gè)月內(nèi)，各組僅出現(xiàn) 1 只大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)死亡，存活率為82.2%。說(shuō)明神經(jīng)干細(xì)胞移植方法成熟，動(dòng)物存活率高。

2.3 PD 模型大鼠行為學(xué)的改變

神經(jīng)干細(xì)胞移植 10 d 后，每周做旋轉(zhuǎn)測(cè)試，其中 42.9% 的 PD 模型大鼠在移植 10 d 后均出現(xiàn)了行為學(xué)的改善。在隨后的 3 個(gè)月內(nèi)，其余大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)也明顯減少，且有進(jìn)一步改善的趨勢(shì)。而生理鹽水對(duì)照組，大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)沒(méi)有明顯變化。NSC 高劑量組移植 8 周后與移植前比較有顯著性差異（P＜ 0.05）；其余各組移植前后比較均無(wú)顯著差異（P＞ 0.05）。組間比較，PD 模型大鼠移植前相互比較無(wú)顯著性差異（P＞ 0.05）；NSC 混合組移植后 5、6、8、9 周與對(duì)照組比較有顯著性差異。（P＜ 0.05）；NSC 低劑量組移植后 6、8 周與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜ 0.05）；NSC 高劑量組移植后 6、8 周與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05），詳見(jiàn)圖 2。

2.4 大鼠腦組織 MAP-2 抗體標(biāo)記神經(jīng)元切片結(jié)果

腦內(nèi)定點(diǎn)移植 hNSCs 的 PD 大鼠模型，在紋狀體移植側(cè)可見(jiàn)一明顯針道，針道兩側(cè)明顯可見(jiàn)MAP-2 抗體標(biāo)記的神經(jīng)元，即移植存活的干細(xì)胞，（圖 3），說(shuō)明植入大鼠紋狀體的 hNSCs 存活，且能分化為神經(jīng)元。

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的細(xì)胞，是人體的種子細(xì)胞，被醫(yī)學(xué)界稱為“萬(wàn)用細(xì)胞”。以干細(xì)胞治療為核心的再生醫(yī)學(xué)，在神經(jīng)、血液、心血管、生殖等系統(tǒng)和肝、腎、胰等器官的重大疾病治療方面發(fā)揮作用，其中神經(jīng)干細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷修復(fù)和神經(jīng)退行性疾病治療方面展現(xiàn)出驚人的潛力[14]。與誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞移植相比，人神經(jīng)干細(xì)胞解決了潛在的致癌性、組織相容性和表觀遺傳性變異等問(wèn)題[15-16]，但神經(jīng)干細(xì)胞自身存在來(lái)源困難和數(shù)量有限的難題，因此臨床治療工作還是難以開(kāi)展。本研究從流產(chǎn)胎兒中分離出神經(jīng)干細(xì)胞，在體外連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá) 12 個(gè)月，遺傳性穩(wěn)定[12]，可為神經(jīng)干細(xì)胞移植提供可靠、用之不竭的細(xì)胞來(lái)源。體外培養(yǎng) 12 個(gè)月的神經(jīng)干細(xì)胞球分化后，可見(jiàn)典型的神經(jīng)元形態(tài)及新型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，可判斷此類細(xì)胞仍具有良好的增殖和分化能力。

帕金森病（PD）是一種起病隱匿的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要特點(diǎn)為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)乃至黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)末梢減少，從而引起震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩等一系列綜合癥狀[17]。但是動(dòng)物不會(huì)自然發(fā)生該病，因此，研究中需要建立大鼠 PD 模型。PD 大鼠模型的制備是采用顱內(nèi)定位注射 6-OHDA，減少黑質(zhì) DA 神經(jīng)元的數(shù)量，模擬人 PD 病理、行為學(xué)的改變，判定 PD 大鼠模型的成功[18-19]。本研究成功建立了大鼠 PD 模型，然后將長(zhǎng)期連續(xù)培養(yǎng)的hNSCs 采用立體定向技術(shù)注射進(jìn)入腦內(nèi)紋狀體部位，連續(xù) 3 個(gè)月觀察移植后 PD 模型大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，證實(shí)了神經(jīng)分化細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植更有利于 PD 的治療。這與神經(jīng)分化細(xì)胞能夠分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF），促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的存活和分化有關(guān)[20-21]。結(jié)果表明，hNSCs 能持續(xù)數(shù)月在大鼠腦內(nèi)發(fā)揮作用，降低 PD 模型大鼠的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，達(dá)到改善 PD 癥狀的目的。而在用神經(jīng)干細(xì)胞治療PD 模型大鼠的實(shí)驗(yàn)中，治療效果與移植細(xì)胞的種類和數(shù)量密切相關(guān)。

本研究用于移植的 hNSCs，在體外未經(jīng)任何特殊處理，但通過(guò) MAP-2 抗體對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行標(biāo)記，在紋狀體移植側(cè)發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元，即移植存活的hNSCs，可推測(cè)腦內(nèi)含有誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化成DA 神經(jīng)元的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)中被移植的大鼠沒(méi)有出現(xiàn)明顯的排斥反應(yīng)，也無(wú)炎癥反應(yīng)，說(shuō)明 hNSCs 免疫排斥反應(yīng)小，適合長(zhǎng)期在受體中存活，能起到細(xì)胞替代作用，此外，移植后該細(xì)胞還可以分化成 DA神經(jīng)元，在 PD 診療方面具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

然而，本次研究?jī)H僅在移植部位發(fā)現(xiàn)了存活和分化的 hNSCs，未觀察到移植 hNSCs 向周圍腦組織的遷移現(xiàn)象。在接下來(lái)的研究中，應(yīng)對(duì)未遷移的原因及移植后多巴胺能神經(jīng)元的存活時(shí)間做進(jìn)一步的探討，挑選出 hNSCs 移植的最佳部位、最佳時(shí)間和生存環(huán)境，為臨床治療帕金森病提供更有力的依據(jù)。