趙躍，高夢遠，劉洪濤，李文燕，何紅偉，王菊仙

血漿膽固醇水平升高是冠狀動脈疾?。╟oronary artery disease，CAD）的主要危險因素[1]，因此降低膽固醇水平有利于預防 CAD。在肝臟中，膽固醇被代謝成膽汁酸并釋放到十二指腸中[2]，其中超過 90% 的膽汁酸被回腸頂端鈉依賴性膽酸轉(zhuǎn)運體蛋白（ASBT）重吸收，并且通過腸肝循環(huán)運回到肝臟中[3-6]。膽汁酸螯合劑（BASs）的使用已經(jīng)證明增加膽汁酸的排泄可以降低肝臟和血清中的膽固醇水平。因此，抑制 ASBT 功能可以減少膽汁酸的重吸收，從而促進膽汁酸的合成，進而增加膽固醇的消耗[7-9]。此外，由于 ASBT 位于回腸內(nèi)腔的頂端膜上，抑制劑可以不進入循環(huán)系統(tǒng)而阻斷 ASBT 活性。因此，ASBT 抑制劑一直被認為是治療高膽固醇血癥的新策略[10-12]。

相關(guān)的研究表明，喹啉類、苯并硫?類和萘酚類等 ASBT 抑制劑 S-1647[13]、S-8921[14]、R-146224[15]、SC-435[16]和 R-16B[17]在動物模型中均可以阻斷膽汁酸重吸收并顯著降低膽固醇水平（圖 1）。已報道的 ASBT 抑制劑 S-8921、R-146224、R-16B 和 SC-435 結(jié)構(gòu)中含有烷氧基苯基、長鏈烷烴或?qū)Χ妆竭B接的對稱性叔胺或季銨鹽的結(jié)構(gòu)片段。而本課題組報道的系列化合物中1-(2,4-二氟苯基)-7-N,N-二甲氨基-4-氧代-1,4-二氫-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（4a1）也具有潛在的抑制 ASBT 的活性[18]。前期構(gòu)效關(guān)系研究表明，化合物 4a1結(jié)構(gòu)中 7 位 N,N-二甲基氨基和 3 位 3,5-二氟苯酰胺基均有利于 ASBT 的抑制活性?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本文以 4a1為先導化合物，利用拼合原理，將烷氧基苯基及直鏈烷烴或?qū)Χ妆竭B接的對稱性叔胺或季銨鹽基團引入到先導化合物 4a1的 N-1 位，設計、合成了一系列-1-(烷氧基苯基)-7-二甲氨基-4-氧代-1,4-二氫-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)-甲酰胺類化合物（圖 2），以期獲得活性更優(yōu)的 ASBT 抑制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

梅特勒 MP-70 熔點儀為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品，溫度計未經(jīng)校正；Bruker ARX-400、Bruker ARX-500 型核磁共振儀為德國 Bruker 公司產(chǎn)品；Agilent-1100 型四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀為美國Agilent 公司產(chǎn)品；MicroBeta 2 液閃儀為美國 PE公司產(chǎn)品；所有試劑均為市售分析純或化學純。

圖 1 ASBT 抑制劑的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structures of ASBT inhibitors

圖 2 目標化合物設計思想Figure 2 Design of target compounds

1.2 方法

1.2.1 目標化合物的合成 以 2,6-二氯煙酰乙酸乙酯（1）為起始原料，參考喹諾酮類化合物的合成方法[19]，經(jīng)縮合、取代和水解反應依次制得化合物 2 ～ 6，6 經(jīng)混合酸酐法與 3,5-二氟苯胺縮合得到 7，7 再經(jīng) NaOH-H2O-EtOH 體系水解得到 8，8 與二溴取代烷烴縮合得到化合物 9a ～ 9f，最后與伯胺或叔胺反應得到相應的目標產(chǎn)物 10a ～ 10f（圖 3）。

1.2.2 ASBT 抑制活性測試方法 采用人HEK293T 細胞，用 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)，以 30 萬/孔鋪到 12 孔板中，同時用pcDNA3.1/hASBT 質(zhì)?；?pcDNA3.1 空載體進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細胞培養(yǎng) 24 h。ASBT 活性分析：12 孔板的細胞用預熱的基礎溶液溫和地清洗兩次，然后將 0.5 ml 含有 1 μCi/ml3H 標記的?；悄懰岷椭付舛鹊拇郎y化合物的基礎溶液加入到12 孔板中，37 ℃ 靜止 10 min 后用預冷基礎溶液洗 3 遍，然后每孔加 0.3 ml 裂解液裂解細胞，再將裂解液轉(zhuǎn)入到液閃儀中，加入 0.7 ml 的閃爍液，用 MicroBeta2 液閃儀測定。用如下方程計算待測樣品的抑制率：

其中，A 為加入待測樣品與3H 標記的?；悄懰岷鬁y定的攝入細胞的3H 值；B 為加入空白對照樣品與3H 標記的?；悄懰岷鬁y定的攝入細胞的3H 值；C 為轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1 空載體加入空白對照樣品與3H 標記的?；悄懰岷鬁y定的攝入細胞的3H 值。

圖 3 目標化合物合成路線Figure 3 The synthetic pathway of target compounds

2 結(jié)果

2.1 目標化合物的合成

共合成目標化合物 48 個，化合物結(jié)構(gòu)均經(jīng)1H-NMR 和 MS 確證。部分代表性目標化合物的1H-NMR 和 MS 數(shù)據(jù)如下：

2.1.1 1-{3-[4-(三乙胺溴化物-1-基)丁氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10a1） 白色固體粉末，產(chǎn)率 52.7%，mp：239.0 ～ 240.3 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.41（9H，s），2.04（4H，s），3.06（6H，s），3.49 ～ 3.55（8H，m），3.94（3H，s），4.14（2H，s），6.55（1H，t，J= 8.2 Hz），6.75（1H，d，J= 8.9 Hz），6.96 ～ 7.06（3H，m），7.42（2H，d，J= 8.0 Hz），8.45（1H，d，J= 9.0 Hz），9.02（1H，s），12.60（1H，s）。ESI-MS m/z：622.38[M+H]+。

2.1.2 1-{3-[4-(N-甲基吡咯烷溴化物-1-基)丁氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10a3） 白色固體粉末，產(chǎn)率 66.5%，mp：245.3 ～ 246.9 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：2.01 ～ 2.09（5H，m），2.31 ～ 2.35（5H，m），3.04（6H，s），3.32（3H，s），3.88 ～ 3.92（6H，m），3.94（3H，s），4.11（2H，s），6.53（1H，t，J= 8.2 Hz），6.72（1H，d，J=8.9 Hz），6.97 ～ 7.03（3H，m），7.39（2H，d，J=8.0 Hz），8.44（1H，d，J= 9.0 Hz），8.89（1H，s），12.62（1H，s）。ESI-MS m/z：606.32 [M+H]+。

2.1.3 1-{3-[5-(三乙烯二胺溴化物-1-基)戊氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10b3） 白色固體粉末，產(chǎn)率 60.5%，mp：290.8 ～ 291.9 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.61 ～ 1.65（2H，m），1.89 ～ 1.95（4H，m），3.03（6H，s），3.25（6H，t，J= 6.4 Hz），3.64 ～ 3.69（8H，m），3.95（3H，s），4.03（2H，t，J= 5.6 Hz），6.53（1H，t，J=8.2 Hz），6.70（1H，d，J= 8.9 Hz），6.97 ～ 7.04（3H，m），7.36（2H，d，J= 8.0 Hz），8.45（1H，d，J=9.0 Hz），8.78（1H，s），12.69（1H，s）。ESI-MS m/z：647.31 [M+H]+。

2.1.4 1-{3-[5-(嗎啉-1-基)戊氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10b4） 白色固體粉末，產(chǎn)率 51.3%，mp：200.1 ～ 201.6 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.51 ～ 1.56（6H，m），1.88～ 1.91（2H，m），2.47（4H，s），3.02（6H，s），3.72 ～ 3.75（4H，m），3.95（3H，s），4.00（2H，t，J= 5.6 Hz），6.53（1H，t，J= 8.2 Hz），6.70（1H，d，J= 8.9 Hz），6.95（1H，s），6.97（2H，s），7.38（2H，d，J= 8.0 Hz），8.45（1H，d，J= 9.0 Hz），8.82（1H，s），12.67（1H，s）。ESI-MS m/z：622.28[M+H]+。

2.1.5 1-{3-[6-(哌啶-1-基)己氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10c5） 白色固體粉末，產(chǎn)率 54.8%，mp：185.3 ～ 186.9 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.39（4H，s），1.83 ～ 1.90（6H，m），2.47（8H，s），3.02（6H，s），3.52（2H，s），3.95（3H，s），3.98（2H，t，J= 6.8 Hz），6.53（1H，t，J= 9.2 Hz），6.70（1H，d，J= 9.1 Hz），6.94（1H，s），6.96（2H，s），7.38（2H，d，J=7.9 Hz），8.46（1H，d，J= 9.0 Hz），8.82（1H，s），12.68（1H，s）。ESI-MS m/z：634.36 [M+H]+。

2.1.6 1-{3-[6-(N-甲基哌啶溴化物-1-基)己氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10c6） 白色固體粉末，產(chǎn)率 59.6%，mp：238.3 ～ 239.8 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.78（5H，s），1.88 ～ 1.90（5H，m），2.35（2H，s），3.05（6H，s），3.31（3H，s），3.47（2H，s），3.70 ～ 3.74（6H，m），3.95（3H，s），4.04（2H，t，J= 6.6 Hz），6.54（1H，t，J= 8.8 Hz），6.74（1H，d，J= 9.1 Hz），6.97（2H，s），7.18（1H，s），7.42（2H，d，J= 8.0 Hz），8.45（1H，d，J= 9.0 Hz），8.82（1H，s），12.66（1H，s）。ESI-MS m/z：648.44 [M+H]+。

2.1.7 1-{3-[7-(吡啶溴化物-1-基)庚氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10d7） 白色固體粉末，產(chǎn)率 66.3%，mp：235.9 ～ 237.5 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.46（4H，s），1.84 ～ 1.85（2H，m），2.09（2H，s），3.05（6H，s），3.95（3H，s），4.06（2H，t，J= 6.8 Hz），5.04（2H，t，J=7.2 Hz），6.55（1H，t，J= 9.2 Hz），6.77（1H，d，J= 9.1 Hz），6.96（2H，s），7.08（1H，s），7.45（2H，d，J= 7.9 Hz），8.03（2H，t，J= 6.7 Hz），8.38 ～ 8.45（2H，m），9.17（1H，s），9.56（2H，d，J= 5.5 Hz），12.63（1H，s）。ESI-MS m/z：642.45 [M+H]+。

2.1.8 1-{3-[7-(4-甲基哌啶-1-基)庚氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10d8） 白色固體粉末，產(chǎn)率 55.2%，mp：187.3 ～ 188.8 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.98（3H，s），1.38 ～ 1.47（8H，m），1.58（6H，s），1.72（4H，s），1.81 ～ 1.88（3H，m），3.03（6H，s），3.95（3H，s），3.98（2H，t，J= 5.6 Hz），6.53（1H，t，J= 8.2 Hz），6.70（1H，d，J= 8.9 Hz），6.94（1H，s），6.96（2H，s），7.38（2H，d，J= 8.0 Hz），8.46（1H，d，J= 9.0 Hz），8.82（1H，s），12.69（1H，s）。ESI-MS m/z：662.48[M+H]+。

2.1.9 1-{3-[8-(吡咯烷-1-基)辛氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10e1） 白色固體粉末，產(chǎn)率 50.9%，mp：182.6 ～ 183.9 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.34（6H，s），1.44（2H，s），1.66（4H，s），1.82 ～ 2.02（6H，m），2.65（4H，s），3.02（6H，s），3.95（3H，s），3.98（2H，t，J= 6.6 Hz），6.53（1H，t，J= 8.8 Hz），6.70（1H，d，J= 9.1 Hz），6.95 ～ 6.96（3H，m），7.38（2H，d，J= 8.0 Hz），8.46（1H，d，J= 9.0 Hz），8.82（1H，s），12.68（1H，s）。ESI-MS m/z：648.43 [M+H]。

2.1.10 1-{3-[4-(二乙胺基-1-基)甲基芐氧基]-4-甲氧基苯基}-7-N,N-二甲氨基-1,4-二氫-4-氧代-1,8-萘啶-3-N-(3,5-二氟苯基)甲酰胺（10f1） 白色固體粉末，產(chǎn)率 50.5%，mp：163.1 ～ 164.6 ℃。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：1.05（6H，s），2.53（4H，s），3.01（6H，s），3.57（2H，s），3.97（3H，s），5.11（2H，s），6.53（1H，t，J= 9.2 Hz），6.69（1H，d，J= 9.1 Hz），6.99（3H，s），7.36 ～ 7.44（6H，m），8.45（1H，d，J= 9.0 Hz），8.77（1H，s），12.66（1H，s）。ESI-MS m/z：642.32 [M+H]+。

2.2 ASBT 抑制活性

以 S-1647 為陽性對照，采用放射性結(jié)合試驗（RBA）法，測定了 48 個目標化合物的 ASBT 抑制活性，其 ASBT 活性抑制率結(jié)果如表 1 所示。目標化合物均具有 ASBT 抑制活性，其中 8 個化合物抑制活性明顯高于陽性對照 S-1647（76.1%）。特別是化合物 10b2、10c3、10c6、10d2、10d3、10d6和 10d7，在 10 μmol/L 濃度下對 ASBT 的抑制率均大于 90%。

表 1 目標化合物 10a ～ 10f 的結(jié)構(gòu)及其 ASBT 抑制活性Table 1 The structures and ASBT inhibitory activities of compounds 10a - 10f

續(xù)表 1

續(xù)表 1

3 討論

ASBT 抑制活性結(jié)果表明（表 1），在以 4 ～8 個碳原子直鏈烷基和對二甲苯基為連接鏈的化合物中，烷基鏈的長度為 5 ～ 7 時較為適宜，尤其是烷基鏈長度為 7 時（10d）活性最好；當烷基鏈長度增加到 8 時，活性急劇下降；連接鏈為對二甲苯基時的活性明顯弱于直鏈烷基；這表明連接鏈的長度和結(jié)構(gòu)均對其活性有影響。對于連接鏈末端取代基，吡咯烷取代化合物活性明顯弱于其成季銨鹽相應的化合物（10a2vs10a3、10b1vs10b2、10c1vs10c2和 10d1vs10d2）；哌啶取代的化合物活性明顯弱于其成季銨鹽相應的化合物（10a6vs10a7、10b5vs10b6、10c5vs10c6和 10d5vs10d6）；其他季銨鹽形式的化合物如三乙烯二胺季銨鹽和吡咯季銨鹽也優(yōu)于相對應的叔胺結(jié)構(gòu)化合物。因此末端季銨鹽形式對于化合物抑制 ASBT 活性具有重要的意義，值得進一步深入研究。本文以化合物 4a1為先導化合物，設計、合成了一系列新型 N1-取代-1,8-萘啶-3-甲酰胺類化合物，測定其對 ASBT 的抑制活性，總結(jié)了化合物的初步構(gòu)效關(guān)系，為新型 ASBT的研究奠定了基礎。