摘 要：根據(jù)之前的研究成果體外模擬伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）的組成，并研究其功能特性。結(jié)果表明：采用噻唑藍(lán)法對(duì)復(fù)合n-3 PUFAs作用的敏感細(xì)胞進(jìn)行篩選，證實(shí)伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs在30～180 μmol/L劑量范圍對(duì)HepG2、MV3和A375腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，且HepG2細(xì)胞對(duì)復(fù)合肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs的敏感度最高；HepG2的細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化與復(fù)合n-3 PUFAs呈現(xiàn)明顯的時(shí)效和量效關(guān)系；采用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素和碘化丙啶雙染法對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，證實(shí)伊拉兔肌內(nèi)復(fù)合磷脂n-3 PUFAs的凋亡作用；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合n-3 PUFAs及其單體（α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸）均能夠引起HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的改變，它們通過(guò)顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)丙二醛的累積量以及活性氧的相對(duì)熒光強(qiáng)度水平，同時(shí)下調(diào)超氧化物歧化酶的活力實(shí)現(xiàn)對(duì)HepG2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，其中二十二碳六烯酸在非酶促氧化反應(yīng)中發(fā)揮主要作用，這是肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：伊拉兔；肌內(nèi)磷脂；n-3多不飽和脂肪酸；抗腫瘤；脂質(zhì)過(guò)氧化

Abstract： As an extension of our previous work， the composition of n-3 polyunsaturated fatty acids （PUFAs） in intramuscular phospholipids of Hyla rabbit was simulated in vitro to evaluate their functional characteristics. The sensitivity of various tumor cells to the formulation was tested by the methyl thiazolyl tetrazolium method. It turned out that the formulation at doses in the range of 30–180 μmol/L repressed the growth of HepG2， MV3 and A375 tumor cells， HepG2 cells being most sensitive to the formulation. The formulation affected the morphology and quantity of HepG cells in a time- and dose-dependent manner and it induced apoptosis in the tumor cells as determined by Annexin V-fluorescin isothiocyanate and propidium iodide double staining kit. Furthermore， the formulation and the individual PUFAs （α-linolenic acid， eicosapentaenoic acid， docosapentaenoic acid， and docosahexenoic acid （DHA）） could alter oxidative stress in HepG cells and their apoptosis-inducing activity was associated with a significant increase in cellular malondialdehyde accumulation and the relative fluorescence intensity of reactive oxygen species and with a decrease in superoxide dismutase activity. In addition， DHA played a major role in the non-enzymatic oxidation reaction.

Keywords： Hyla rabbit； intramuscular phospholipids； n-3 polyunsaturated fatty acids； anticancer effect； lipid peroxidation

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201804002

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2018）04-0007-07

根據(jù)世界癌癥組織的報(bào)告，惡性腫瘤導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)全球總死亡人數(shù)的12%，甚至在很多國(guó)家1/4的死亡原因都?xì)w結(jié)于癌癥[1]。全球診斷出來(lái)的最常見(jiàn)的癌癥包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌以及結(jié)直腸癌等[1-2]。大量流行病學(xué)資料顯示，攝入脂肪的種類(lèi)和數(shù)量與惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系[3-4]。很多研究表明，高水平飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）的攝入會(huì)增加罹患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)，而n-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）的攝入能夠大大降低這種風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也有利于腫瘤病人的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)[5-7]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，n-3 PUFAs具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化和誘導(dǎo)腫瘤凋亡的作用，如對(duì)胃癌[8-9]、乳腺癌[10]、結(jié)直腸癌、前列腺癌[11]和胰腺癌[12]等療效顯著。長(zhǎng)鏈的n-3 PUFAs，尤其是二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用更為突出，并且誘導(dǎo)腫瘤凋亡的途徑與機(jī)制是復(fù)雜多變的[13-14]。

本研究首先通過(guò)探究伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs對(duì)HepG2（人肝癌細(xì)胞株）、MV3（野生型黑素瘤細(xì)胞株）和A375（人黑素瘤細(xì)胞株）的作用，篩選敏感細(xì)胞株；其次，通過(guò)n-3 PUFAs與敏感細(xì)胞株的時(shí)效及量效關(guān)系確定不同作用劑量與培養(yǎng)時(shí)間對(duì)敏感細(xì)胞株的影響，進(jìn)而對(duì)不同n-3 PUFAs添加量和培養(yǎng)時(shí)間條件下敏感細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)、抑制效果和細(xì)胞凋亡等指標(biāo)進(jìn)行深入研究，探討伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs對(duì)敏感細(xì)胞株的作用效果；此外，通過(guò)試劑盒法檢測(cè)伊拉兔肌內(nèi)磷脂中n-3 PUFAs對(duì)腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，即分別用α-亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）、EPA、二十二碳五烯酸（docosapentaenoic acid，DPA）、DHA和復(fù)合n-3 PUFAs處理敏感細(xì)胞株，檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的變化，以期揭示伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，同時(shí)也為兔產(chǎn)業(yè)的推廣和推進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻兔肉取自西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院養(yǎng)殖場(chǎng)的伊拉配套系肉兔，同一批次飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境和飼料均相同。公兔，20 只，60 日齡，體質(zhì)量（2.15±0.12） kg。肉兔經(jīng)屠宰分割后，取背部最長(zhǎng)肌作為實(shí)驗(yàn)原料，用裝有碎冰的保溫箱將其立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室（20 min之內(nèi)），真空包裝后于-18 ℃保藏備用。使用前將原料在4 ℃條件下解凍24 h后，去掉表面可見(jiàn)脂肪和筋膜，分割切塊。

n-3 PUFAs：ALA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）、EPA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）、DPA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%）和DHA標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.8%） 上海安譜儀器有限公司；HepG2、A375和MV3細(xì)胞株 西南大學(xué)潔凈能源與先進(jìn)材料研究院細(xì)胞庫(kù)。

14%三氟化硼甲醇溶液（色譜純） 美國(guó)CNW公司；脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純） 美國(guó)Sigma公司；PBS溶液、DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胎牛血清 天津TBD公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）和胰酶 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑和細(xì)胞裂解液RIPA Buffer 美國(guó)Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescin isothiocyanate，Annexin V-FITC）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒、SOD測(cè)定試劑盒、ROS測(cè)定試劑盒和蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；三氯甲烷、甲醇、氯化鈉、氯化鈣、無(wú)水硫酸（均為分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

QP-2010氣相色譜儀 日本Shimadzu公司；Rtx-Wax毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Restek公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 上海市亞榮生化儀器廠；SHA-CD恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；DG3022酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；DFM-20C熒光倒置顯微鏡 美國(guó)Olympus公司；NU-3500細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國(guó)Nuaice公司；DY89-1玻璃勻漿器 寧波新芝儀器有限公司；H1650-W高速離心機(jī) 湖南湘儀集團(tuán)；F-7000熒光分光光度儀 日立高新技術(shù)公司；SG-40干式試管加熱器 德國(guó)HLC生物技術(shù)公司；SX-700高壓滅菌鍋 日本Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs的組成測(cè)定磷脂的提?。褐咎崛?、肌內(nèi)中性脂肪和磷脂的分離采用薛山等[15-16]的方法。

磷脂脂肪酸組成分析：樣品前處理及脂肪酸甲酯的氣相色譜（gas chromatography，GC）測(cè)定均參考文獻(xiàn)[15-16]的方法；脂肪酸的定性分析采用與37 種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比的方法進(jìn)行，定量分析采用面積歸一化法，脂肪酸含量用單個(gè)脂肪酸占總脂肪酸的相對(duì)比例（%）表示。

1.3.2 伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs的制備

1.3.2.1 母液配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)品，分別配制20 mmol/L的ALA、4 000 ?mol/L的EPA、4 000 ?mol/L的DPA和4 000 ?mol/L的DHA儲(chǔ)備液；儲(chǔ)備液經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾后分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)將儲(chǔ)備液用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

1.3.2.2 復(fù)合n-3 PUFAs儲(chǔ)備液的配制

按照文獻(xiàn)[17-18]測(cè)得的60 日齡伊拉公兔（體質(zhì)量（2.15±0.12） kg）背部最長(zhǎng)肌磷脂的n-3 PUFAs組成進(jìn)行肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs的復(fù)配，如表1所示。用無(wú)血清培養(yǎng)液將復(fù)配所得復(fù)合n-3 PUFAs配制成4 000 ?mol/L的儲(chǔ)備液，經(jīng)0.22 ?m濾膜過(guò)濾后分裝于1.5 mL離心管中，-20 ℃避光保存?zhèn)溆?。需要指出的是，?dāng)NaOH的終濃度低于0.001 mol/L或乙醇的終體積分?jǐn)?shù)低于0.6%時(shí)，均對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。

1.3.3 腫瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制

HepG2（人肝癌細(xì)胞株）生長(zhǎng)培養(yǎng)基：RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗；A375（人黑素瘤細(xì)胞株）生長(zhǎng)培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗；MV3（野生型黑素瘤細(xì)胞株）生長(zhǎng)培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗。

1.3.4 n-3 PUFAs敏感細(xì)胞株的篩選

1.3.4.1 細(xì)胞接種

參考Dai Jinfeng等[9]的方法。輕輕吸出原有培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞，先用1 mL PBS溶液反復(fù)清洗2～3 次，再向培養(yǎng)瓶中加入0.25%胰酶消化液（含有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA））進(jìn)行消化，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放回37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化約5 min；取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用倒置顯微鏡進(jìn)行光學(xué)觀察，待腫瘤細(xì)胞逐漸變圓時(shí)，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使貼壁細(xì)胞充分脫落，之后立即加入3 mL新鮮培養(yǎng)基以終止胰酶消化；輕輕搖勻后，慢慢吸出管內(nèi)含有細(xì)胞的胰酶消化液，于1 000 r/min條件下低溫離心5 min；棄去管內(nèi)的上清液，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕吹打，制成濃度均勻的細(xì)胞懸液，以103～105 個(gè)/孔的濃度分別鋪于6孔板，每個(gè)孔的細(xì)胞懸液體積均為3 mL。

1.3.4.2 細(xì)胞加藥

采用直接加藥法。向上述6孔板中分別加入0、22.5、45.0、67.5、90.0、112.5 μL的4 000 μmol/L復(fù)合n-3 PUFAs，使其終濃度分別為0、30、60、90、120、150 μmol/L；用排槍將每孔的溶液吹打均勻后，將6 個(gè)孔的細(xì)胞懸液以每孔100 μL分別接種于3 塊96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)測(cè)定。每個(gè)處理組均設(shè)置3 個(gè)平行孔，每孔均設(shè)置等體積的培養(yǎng)液作為對(duì)照，為避免培養(yǎng)過(guò)程中水分揮發(fā)而引起的邊緣效應(yīng)，邊緣孔均設(shè)為培養(yǎng)液對(duì)照。

1.3.4.3 呈色

細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液10 μL；37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，將細(xì)胞從培養(yǎng)箱中取出，輕輕將孔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)上清液去除；分別向細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液，150 μL/孔；將96孔板于脫色搖床上振蕩10 min，使得結(jié)晶物能夠充分溶解。

用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A），并按照下式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.3.5 MTT法檢測(cè)敏感細(xì)胞株的增殖

采用直接加藥法對(duì)腫瘤細(xì)胞加藥，具體操作同1.3.4.2和1.3.4.3節(jié)。

1.3.6 敏感細(xì)胞的形態(tài)觀察

將敏感細(xì)胞的密度調(diào)整為1×105 個(gè)/mL，分別接種到6孔板，3 mL/孔；分別向上述6孔板的各孔中加入0、22.5、45.0、67.5、90.0、112.5 μL的4 000 μmol/L復(fù)合n-3 PUFAs，使其終濃度分別為0、30、60、90、120、150 μmol/L。同時(shí)設(shè)置不含脂肪酸的培養(yǎng)液作為對(duì)照組，培養(yǎng)24、48、72 h后分別用低、中、高倍倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.7 敏感細(xì)胞凋亡的測(cè)定

根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒法進(jìn)行操作。取約1×105～5×105 個(gè)重懸的敏感細(xì)胞，1 000×g條件下離心5 min；去除上清液，加入500 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，再次輕輕重懸敏感細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC溶液，混合均勻后再向反應(yīng)體系中加入5 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）溶液，輕輕混勻；在室溫（20～25 ℃）條件下，采用鋁箔避光孵育10 min；將上述染色后的細(xì)胞懸液滴于載玻片上，并用蓋玻片輕輕蓋上細(xì)胞，即可用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.8 n-3 PUFAs及其單體處理對(duì)敏感細(xì)胞氧化損傷的影響

敏感細(xì)胞中MDA的積累量測(cè)定：釆用商業(yè)化的MDA試劑盒進(jìn)行測(cè)定。待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量按照考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測(cè)定；敏感細(xì)胞中SOD的活性測(cè)定：釆用商業(yè)化的SOD試劑盒進(jìn)行測(cè)定；敏感細(xì)胞中ROS的變化量測(cè)定：釆用商業(yè)化的ROS試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，釆用Origin 8.0軟件繪圖。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均值比較釆用單因素方差分析，2 組均值比較釆用非配對(duì)t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腫瘤細(xì)胞對(duì)n-3 PUFAs敏感度的比較

由圖1可知，伊拉兔背部最長(zhǎng)肌肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs對(duì)HepG2、MV3和A375 3 種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，且作用濃度不同，細(xì)胞的相對(duì)活力也存在差異。HepG2細(xì)胞受伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs的抑制較之MV3和A375更為敏感。王占有[19]的研究表明，n-3 PUFAs（EPA和DHA）對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用（P<0.05），并且抑制作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加；當(dāng)用EPA培養(yǎng)24、48、72 h后，其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（89.09±1.56）、（72.68±2.05）、（56.4±1.38） ?g/mL；當(dāng)用DHA培養(yǎng)24、48、72 h后，其對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制的IC50分別為（160.87±2.13）、（82.39±1.76）、（70.71±1.52） ?g/mL。然而，目前有關(guān)n-3 PUFAs對(duì)MV3和A375的誘導(dǎo)作用鮮有報(bào)道。

鑒于HepG2細(xì)胞對(duì)n-3 PUFAs的較強(qiáng)敏感性，本研究選擇HepG2細(xì)胞作為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步探討n-3 PUFAs對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響及作用機(jī)制。

2.2 n-3 PUFAs對(duì)HepG2細(xì)胞的時(shí)效與量效作用

由圖2可知，HepG2細(xì)胞與n-3 PUFAs之間有顯著的時(shí)效與量效關(guān)系。在0～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著n-3 PUFAs濃度的增加，HepG2細(xì)胞活力顯著下降

（P<0.05）。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為48 h、n-3 PUFAs添加濃度為200 μmol/L時(shí)，HepG2的細(xì)胞活力降至（25.70±1.12）%。可見(jiàn)，n-3 PUFAs對(duì)HepG2的細(xì)胞活力影響明顯；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72 h時(shí)，高劑量的n-3 PUFAs使得腫瘤細(xì)胞的活力顯著下降，其中180、200 μmol/L處理組HepG2的細(xì)胞活力分別降至（5.61±0.16）%和（2.57±0.11）%，此時(shí)可以認(rèn)為細(xì)胞的活力幾乎為零。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用30～150 μmol/L的n-3 PUFAs對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、觀察及測(cè)定。

王占有[19]的研究表明：當(dāng)分別用60 ?g/mL的EPA和DHA作用于HepG2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率分別為12.31%和6.52%；當(dāng)分別用80 ?g/mL的EPA和DHA作用于HepG2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的凋亡率分別為32.12%和14.67%，且不同濃度作用下的凋亡率具有顯著性差異（P<0.05）。

2.3 n-3 PUFAs對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響

由圖3可知，不同n-3 PUFAs劑量和作用時(shí)間對(duì)HepG2細(xì)胞的數(shù)量和形態(tài)均有顯著影響。對(duì)照組HepG2細(xì)胞輪廓清晰，呈梭形，細(xì)胞之間結(jié)構(gòu)緊密，生長(zhǎng)旺盛；而處理組HepG2細(xì)胞的形狀發(fā)生改變，呈無(wú)規(guī)則狀態(tài)，細(xì)胞的輪廓感降低，細(xì)胞浮起，細(xì)胞間距離增加、結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞數(shù)量有所減少，死細(xì)胞增多。推測(cè)此時(shí)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)開(kāi)始減少，細(xì)胞器發(fā)生一定程度的萎縮。凋亡細(xì)胞的核膜會(huì)發(fā)生破裂，導(dǎo)致胞質(zhì)溶出，進(jìn)而逐漸形成凋亡小體[20]。處理72 h后，HepG2細(xì)胞形態(tài)的變化更為明顯，這也與MTT測(cè)定結(jié)果相吻合。

圖3中不僅可以觀察到細(xì)胞凋亡早期產(chǎn)生的綠色熒光、壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的凋亡體發(fā)出的紅色熒光以及壞死細(xì)胞膜內(nèi)發(fā)出的綠色熒光，還可以明顯觀察到相應(yīng)凋亡細(xì)胞形態(tài)與數(shù)量的差異性變化。由倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果可知，隨著n-3 PUFAs處理劑量的增大，HepG2細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象更為劇烈。同時(shí)，倒置熒光顯微鏡清晰且直接地檢測(cè)到了磷酯酰絲氨酸外翻這一細(xì)胞凋亡的重要形態(tài)特征。細(xì)胞凋亡的發(fā)生通常有多個(gè)明顯的形態(tài)與生化改變，包括細(xì)胞質(zhì)減少、細(xì)胞萎縮、薄膜起泡、染色質(zhì)縮合、吸附力下降、細(xì)胞膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸外翻、DNA碎裂、特定位置蛋白質(zhì)分解以及線粒體膜通透性增加等，而腫瘤細(xì)胞的程序性死亡減慢或者喪失能夠使其逃避細(xì)胞正常生長(zhǎng)增值的調(diào)控機(jī)制[21-23]。

細(xì)胞增殖是多階段、多因子參與的、受到精確而有序細(xì)胞周期調(diào)節(jié)的過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、DNA復(fù)制以及細(xì)胞分裂[24-25]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)或促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡均有利于腫瘤的治療[20]。

薛山[26]的研究認(rèn)為，n-3 PUFAs對(duì)多種惡性疾病均有良好的預(yù)防和治療功效，其生物學(xué)作用機(jī)制包括促脂質(zhì)過(guò)氧化學(xué)說(shuō)、抑制環(huán)氧合酶2和脂氧合酶的表達(dá)、抑制腫瘤血管增生、調(diào)控蛋白酶及抑制相關(guān)癌癥基因編碼蛋白的表達(dá)等多種理論。其中，從脂質(zhì)過(guò)氧化角度來(lái)講，n-3 PUFAs能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（活性氧）的增加，進(jìn)而直接損傷DNA、滅活功能蛋白、阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及基因轉(zhuǎn)錄，從而致使細(xì)胞凋亡。Yu等[27]

的研究表明，n-3 PUFAs能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的積累，這可能是由于其改變了細(xì)胞中Na-K-ATP酶和5-核苷酸酶的活性以及多種抗氧化劑的水平，也可能是由于其提高了抗氧化酶類(lèi)（如SOD、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等）的活力和蛋白激酶c的濃度，促進(jìn)了p53的表達(dá)。通常來(lái)講，n-3 PUFAs對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的促進(jìn)作用與其所含不飽和雙鍵的數(shù)目呈正相關(guān)，并且具有劑量依賴(lài)性。腫瘤細(xì)胞對(duì)于脂肪酸的吸收或代謝與正常細(xì)胞不同，常規(guī)劑量的n-3 PUFAs能夠有選擇性地抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)不損害正常細(xì)胞，這是由于腫瘤細(xì)胞中的抗氧化屏障存在缺陷，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物和自由基會(huì)大量積聚，使其極易遭受過(guò)氧化損傷[28]。

2.4 n-3 PUFAs及其單體對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的影響

作為一種重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，PUFAs具有廣泛的生理功能和生物學(xué)活性，其在預(yù)防和治療癌癥方面扮演著越來(lái)越重要的角色，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，并在一定程度上降低癌細(xì)胞的侵襲力，但是其作用機(jī)制仍尚不明確[29]，Walther等[30]推測(cè)，腫瘤細(xì)胞的脂肪酸氧化作用可能存在缺陷。

由圖4～6可知，伊拉兔n-3 PUFAs及其單體（ALA、EPA、DPA、DHA）均能夠顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞的MDA累積量和ROS的相對(duì)熒光強(qiáng)度水平，同時(shí)下調(diào)SOD的活力。相比之下，5 種n-3 PUFAs對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激影響的大小順序?yàn)镈HA>DPA>n-3 PUFAs>EPA>ALA。其中，DHA作用后HepG2細(xì)胞表現(xiàn)出的高水平ROS熒光強(qiáng)度和MDA積累量可能是由于DHA自身含有多個(gè)不飽和雙鍵引起的，而SOD活力的下調(diào)使得ROS積累，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞造成脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。120 μmol/L的n-3 PUFAs能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平以及脂質(zhì)過(guò)氧化影響HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過(guò)氧化作用越劇烈，細(xì)胞損傷越大，對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力也就越大。曾思敏[31]的研究表明，ALA、EPA、DHA、亞油酸（linoleic acid，LA）、γ-亞麻酸（γ-linolenic acid，GLA）和花生四烯酸（arachidonic acid，AA）6 種PUFAs的添加均能促使胃癌細(xì)胞MGC、SGC中MDA積累量顯著上升，SOD活性顯著下降，ROS生成量大大提高，并進(jìn)一步誘導(dǎo)MGC和SGC細(xì)胞的凋亡，而正常細(xì)胞未受到損害。王占有[19]的研究表明，n-3 PUFAs（EPA和DHA）能夠通過(guò)影響細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)抑制HepG2細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡；EPA和DHA作用于細(xì)胞后，HepG2細(xì)胞中SOD的活力均有顯著下降（P<0.05），且用質(zhì)量濃度分別為80、100 ?g/mL的EPA或DHA處理后，細(xì)胞的SOD活力較之60 ?g/mL處理組顯著降低（P<0.05），細(xì)胞的MDA沉積量均顯著升高（P<0.05）。這與本研究的結(jié)果相似。結(jié)合本研究結(jié)果可知，伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的功效可能主要依托于DHA、DPA和EPA這3 種長(zhǎng)鏈PUFAs發(fā)揮的誘導(dǎo)作用，n-3 PUFAs的不飽和雙鍵越多，作用的主導(dǎo)性越大。因此，在伊拉兔的飼喂養(yǎng)殖、烹飪加工以及貯運(yùn)包裝中，如何提高其原料或產(chǎn)品中長(zhǎng)鏈PUFAs的相對(duì)含量將成為兔肉營(yíng)養(yǎng)與健康課題中值得探討的問(wèn)題。

3 結(jié) 論

伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs在30～180 μmol/L劑量范圍均能夠抑制HepG2、MV3和A375腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)，其中HepG2細(xì)胞對(duì)伊拉兔肌內(nèi)磷脂n-3 PUFAs的敏感性最顯著，并表現(xiàn)出明顯的時(shí)效與量效關(guān)系。通過(guò)Annexin V-FITC和PI雙染法對(duì)HepG2細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，證實(shí)了伊拉兔肌內(nèi)復(fù)合磷脂n-3 PUFAs誘導(dǎo)凋亡的作用。此外，ALA、EPA、DPA、DHA以及n-3 PUFAs均可以引起HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的改變，通過(guò)顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)MDA的累積量以及ROS的相對(duì)熒光強(qiáng)度水平，同時(shí)下調(diào)SOD的酶活力實(shí)現(xiàn)對(duì)HepG2細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用，其中DHA在非酶促氧化反應(yīng)中發(fā)揮主要作用。因此，在伊拉兔肉的膳食營(yíng)養(yǎng)課題中研究如何提高肌內(nèi)磷脂中長(zhǎng)鏈PUFAs，尤其是DHA的相對(duì)含量將有重要意義。

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