隋曉丹

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝脾胃病科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察肝脂溶顆粒對(duì)NAFLD模型大鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)的影響，及肝臟組織TNF-α表達(dá)在非酒精性脂肪肝中的作用并探明調(diào)節(jié)其作用的傳導(dǎo)途徑，為中醫(yī)臨床干預(yù)治療非酒精性脂肪肝提供理論依據(jù)和新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（200±20） g。

1.2 藥物 肝脂溶顆粒：長(zhǎng)春中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室，批準(zhǔn)文號(hào)：長(zhǎng)衛(wèi)制藥字 (96)1367號(hào)。多烯磷脂酰膽堿膠囊：賽諾非安萬(wàn)特（北京）制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20059010。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 非酒精性脂肪肝模型復(fù)制方法 大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后隨機(jī)分為正常組9只、高脂組51只。正常組予普通飼料喂養(yǎng)，高脂組予高脂飼料（88%基礎(chǔ)飼料、10%豬油、2%膽固醇）喂養(yǎng)，自由飲水。12周后隨機(jī)選出7只大鼠（正常組1只，高脂組6只），處死后取肝臟組織進(jìn)行HE染色，驗(yàn)證造模情況。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法 12周后，正常組大鼠普通飼料喂養(yǎng)同時(shí)每日生理鹽水灌胃。高脂組大鼠隨機(jī)分為模型組、多烯磷脂酰膽堿膠囊對(duì)照組（簡(jiǎn)稱(chēng)：對(duì)照組）、肝脂溶顆粒高、中、低劑量組（簡(jiǎn)稱(chēng)：高、中、低劑量組）。繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)每日給予不同藥物進(jìn)行灌胃（模型組：生理鹽水灌胃1 mL/100 g；對(duì)照組：多烯磷脂酰膽堿膠囊水溶液灌胃，按0.14 g/kg體重給藥；高劑量組：100%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按3 g/kg體重給藥；中劑量組：70%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按2.1 g/kg體重給藥；低劑量組：30%濃度肝脂溶顆粒水溶液灌胃，按0.9 g/kg體重給藥）。連續(xù)灌胃4周后取材。

2.3 肝臟組織標(biāo)本采集 腹主動(dòng)脈取血處死大鼠，打開(kāi)腹腔完整分離肝臟，快速取下肝臟組織一部分置于10%中性緩沖福爾馬林溶液中（PH 7.4）固定，常規(guī)脫水后，石蠟包埋備用。

2.4 觀(guān)察指標(biāo) 免疫組化法檢測(cè)肝臟組織TNF-α的表達(dá)。

2.4.1 免疫組織化學(xué)染色方法 石蠟切片常規(guī)脫蠟進(jìn)水；熱修復(fù)抗原；染色。

2.4.2 表達(dá)結(jié)果判定 在光鏡下觀(guān)察切片，根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量判定。表達(dá)細(xì)胞的胞漿中可見(jiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，顏色越深，表示表達(dá)越強(qiáng)。如細(xì)胞胞漿中未出現(xiàn)棕黃色顆粒則為陰性結(jié)果。

TNF-α計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)，按染色區(qū)變化和染色強(qiáng)度分為0～4分：0分：無(wú)染色或染色極弱。1分：局部弱染、染色區(qū)＜25%。2分：局部染色稍強(qiáng)、染色區(qū)25%～50%。3分：肝竇周?chē)蛥R管區(qū)染色增強(qiáng)，染色區(qū)50%～75%。4分：肝竇周?chē)蛥R管區(qū)染色呈強(qiáng)染，染色區(qū)＞75%。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常組肝組織內(nèi)偶見(jiàn)少量淡黃色顆粒，TNF-α蛋白表達(dá)極弱；模型組肝臟組織內(nèi)可見(jiàn)明顯增多的棕黃色顆粒，主要以匯管區(qū)和肝竇周?chē)顬轱@著；其它藥物干預(yù)組肝臟組織內(nèi)棕黃色顆粒與模型組相比明顯減少，表達(dá)強(qiáng)度也減弱，藥物組中高劑量組肝臟組織內(nèi)棕黃色顆粒相對(duì)較少，表達(dá)強(qiáng)度較弱；中劑量組與對(duì)照組相似，肝臟組織內(nèi)棕黃色顆粒數(shù)量級(jí)表達(dá)強(qiáng)度均高于高劑量組；低劑量組肝臟組織內(nèi)可見(jiàn)廣泛黃色顆粒，表達(dá)強(qiáng)于其它藥物干預(yù)組。

半定量評(píng)分結(jié)果示：各NAFLD模型組大鼠肝臟組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)明顯高于正常組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；模型組大鼠肝臟組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)明顯高于各藥物干預(yù)組（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高劑量組大鼠肝臟組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組大鼠肝臟組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)與對(duì)照組比較（P>0.05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低劑量組大鼠肝臟組織內(nèi)TNF-α的表達(dá)高于高、中劑量組及對(duì)照組（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠16周末肝臟組織TNF-α蛋白表達(dá)比較

圖1 大鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)免疫組化染色 （×200）

4 討論

TNF-α是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，TNF-α作為炎性細(xì)胞因子[1]可以通過(guò)增加氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化[2]等方面引起脂肪性肝炎[3]和脂肪性纖維化。TNF-α還是NAFLD發(fā)病過(guò)程中胰島素抵抗的一個(gè)關(guān)鍵性介質(zhì)[4]，在脂肪組織中TNF-α水平與胰島素抵抗呈正相關(guān)[5]，TNF-α主要通過(guò)干擾胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、減少PPARγ的合成及調(diào)節(jié)FFA[6]參與介導(dǎo)肝臟及外周組織的胰島素抵抗，還能夠直接或間接損傷β細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌缺陷。

劉鐵軍教授總結(jié)多年治療非酒精性脂肪肝的臨床經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)濕熱瘀積證自研肝脂溶顆粒[7]，由決明子、枳椇子、澤瀉等組成，諸藥合用，共奏清熱利濕、化瘀消積之功效。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肝脂溶顆粒能夠顯著降低大鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)，進(jìn)而減輕TNF-α對(duì)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)的影響和其細(xì)胞因子的毒性作用，達(dá)到治療NAFLD的目的。其療效與劑量呈正相關(guān)，且對(duì)降低大鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)療效優(yōu)于多烯磷脂酰膽堿膠囊。高脂飲食誘導(dǎo)致NAFLD大鼠肝臟組織TNF-α表達(dá)明顯增高，這可能是大鼠引起非酒精性脂肪肝的機(jī)制之一，肝脂溶顆粒顯著降低了肝臟組織TNF-α表達(dá)，因此，肝脂溶顆粒對(duì)非酒精性脂肪肝的防治作用可能是通過(guò)降低肝臟組織TNF-α表達(dá)而完成的。