郭婷婷，從仁懷，寇秀穎，肖俊勇，萬(wàn)楚筠

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，武漢 430062；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所-無(wú)限極功能油脂聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062；3.油料油脂加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，武漢 430062)

茴香(FoeniculumvulgareMill.)，傘形科茴香屬多年生草本植物，味辛，性溫，《東醫(yī)寶鑒》記載，茴香作為“七仙丹”之一，用于治療須發(fā)早白等癥狀，有滋陰養(yǎng)腎、益氣健脾之功效。茴香全株均含有揮發(fā)油，其中果實(shí)中最為豐富[1]?，F(xiàn)代研究表明，茴香揮發(fā)油具有抗氧化[2]、護(hù)肝[3]、抑菌殺蟲[4]、調(diào)節(jié)腸胃機(jī)能[5]和增強(qiáng)免疫[6]等功效。反式茴香腦作為茴香揮發(fā)油的主要成分，相對(duì)含量為65%～80%[7]，化學(xué)名為反式對(duì)烯丙基茴香醚，外觀呈白色晶體，有甜味，在香料、醫(yī)藥、食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前關(guān)于反式茴香腦絕對(duì)含量的測(cè)定，研究對(duì)象多為木蘭科的八角大料[8,9]，而對(duì)于小茴香的研究甚少。本文利用GC/MS分析比較湖北、新疆、內(nèi)蒙古、四川、江西和廣西不同產(chǎn)地的小茴香揮發(fā)油成分組成，并采用GC外標(biāo)法測(cè)定其中反式茴香腦的絕對(duì)含量。操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，以期為茴香揮發(fā)油的進(jìn)一步開發(fā)利用研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

小茴香：分別產(chǎn)自湖北、新疆、內(nèi)蒙古、四川、江西和廣西，均為2015年采收。反式茴香腦標(biāo)品：購(gòu)于Sigma公司；正己烷：色譜純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

7890A-5975C GC/MS聯(lián)用儀、7890A氣相色譜儀(FID檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣) 美國(guó)安捷倫公司；玻璃揮發(fā)油提取器 湖北詹氏科工懋有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小茴香揮發(fā)油的提取

采用水蒸氣蒸餾法。茴香粉碎過(guò)篩，收集30～60目樣品。按1∶7料液比加入蒸餾水，蒸餾4 h。揮發(fā)油溶液用棕色瓶封裝，于4 ℃下保存。

1.2.2 小茴香揮發(fā)油成分分析

前處理：精確量取0.25 mL小茴香揮發(fā)油(除水后的)加色譜純正己烷定容到5 mL，過(guò)過(guò)濾頭后推入色譜用透明樣品瓶?jī)?nèi)備用。

GC條件：色譜柱：Agilent HP-5MS毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持10 min，以2 ℃/min升到150 ℃，再以5 ℃/min升到200 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣(99.999%)，流速為1 mL/min，分流比為30∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)，電子束能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍35～500 m/z，容積延遲3.0 min。

1.2.3 反式茴香腦含量測(cè)定

1.2.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-5毛細(xì)管柱(0.25 mm×30 mm×0.25 μm)；升溫程序：起始溫度60 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升到250 ℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測(cè)器溫度為250 ℃；載氣為氮?dú)?，流速? mL/min，分流比為50∶1；進(jìn)樣量為1 μL。

1.2.3.2 方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)

線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確量取反式茴香腦標(biāo)品1 mL于5 mL容量瓶中，用正己烷定容搖勻，得反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，以正己烷稀釋成濃度分別為12.5，25.0，50.0，100.0，200.0 μL/mL的對(duì)照溶液。按1.2.3.1方法測(cè)定，以溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析。

精密度實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的RSD值。

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取小茴香，按1.2.1的方法制備5份樣品精油溶液，按1.2.3.1的方法進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD值。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：精密量取同一份標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在0，2，4，6，8 h進(jìn)樣，計(jì)算峰面積的RSD值。

回收率實(shí)驗(yàn)：稱取已知含量的小茴香樣品40 g左右，共5份，分別加入標(biāo)品30 μL。按1.2.1的方法制備樣品，再按1.2.3.1的方法進(jìn)樣，計(jì)算回收率和RSD值。

1.2.3.3 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油中反式茴香腦含量測(cè)定

按1.2.1的方法制備不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油，再按1.2.3.1的方法進(jìn)樣，記錄相應(yīng)峰面積，計(jì)算其反式茴香腦含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油含量比較

表1 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油含量比較

由表1可知，6種不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油含量在1.29～2.24 mL/100 g之間，其中揮發(fā)油含量較高的是產(chǎn)自內(nèi)蒙古、新疆的茴香，而產(chǎn)自江西、廣西的茴香揮發(fā)油含量較低。我國(guó)不同產(chǎn)地茴香種子揮發(fā)油含量相差較大可能有兩個(gè)方面原因：一是各地栽培茴香所用種子以地方品種為主，農(nóng)民自種自留，適應(yīng)不同地方的茴香種子在遺傳性狀上發(fā)生了分化，缺乏系統(tǒng)的選育；二是由于各地氣候條件不同，在茴香生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，尤其是在種子成熟期對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累和精油的形成產(chǎn)生了不同的影響，從而造成了區(qū)域差異。

2.2 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量分析

表2 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對(duì)含量

續(xù) 表

對(duì)制備所得小茴香揮發(fā)油進(jìn)行GC/MS定性分析，以色譜峰最高點(diǎn)確定峰位置，應(yīng)用NIST08譜庫(kù)進(jìn)行物質(zhì)檢索定性。通過(guò)各峰面積歸一法確定其相對(duì)含量。由表2可知，共鑒定出21種成分，其中湖北20種，新疆21種，內(nèi)蒙古17種，四川18種，江西18種，廣西18種。以各成分相對(duì)含量高低為標(biāo)準(zhǔn)，小茴香揮發(fā)油成分主要是反式茴香腦、β-水芹烯、月桂烯、對(duì)異丙基甲苯、草蒿腦、檸檬烯、γ-萜品烯、葑酮[10]。植物農(nóng)學(xué)研究證實(shí)精油量及成分比例受物種遺傳、土壤施肥量[11,12]、光照條件[13]、器官[14]及成熟度等因素影響。

2.3 反式茴香腦含量分析

2.3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1.1 線性關(guān)系

經(jīng)計(jì)算得標(biāo)品濃度與峰面積的回歸方程為y=378.18x+399.58(R2=0.9999)，表明二者在12.5～200 μL/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖1。以信噪比(S/N)≥3為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，得出反式茴香腦的檢出限為0.015 μL/mL。

圖1 反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.1.2 精密度

計(jì)算得峰面積的RSD值為1.33%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.3.1.3 重復(fù)性

計(jì)算峰面積的RSD值為1.27%(n=5)，表明該法重現(xiàn)性良好。

2.3.1.4 穩(wěn)定性

計(jì)算峰面積的RSD值為0.84%(n=5)，表明標(biāo)品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.1.5 回收率

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

由表3可知，計(jì)算得反式茴香腦的平均回收率為99.76%，峰面積的RSD值為0.50%(n=5)，表明該測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3.2 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油中反式茴香腦含量分析

圖2 不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油中反式茴香腦含量

由圖2可知，不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油中反式茴香腦的含量有較大差別，以內(nèi)蒙古品種最高(74.45%)，江西(74.25%)次之，新疆(33.42%)最低。綜合不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油含量及揮發(fā)油中反式茴香腦含量結(jié)果可知，相較其他5個(gè)產(chǎn)地，內(nèi)蒙古為最佳小茴香種植產(chǎn)地。

3 結(jié)論

不同產(chǎn)地小茴香揮發(fā)油含量在1.29～2.24 mL/100 g之間，分析其化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)反式茴香腦的含量相對(duì)較高，但差異較大。反式茴香腦濃度在12.5～200 μL/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系(R2=0.9999)，檢出限為0.015 μL/mL；實(shí)驗(yàn)測(cè)得精密度良好，RSD為1.33%(n=5)；測(cè)得重復(fù)性良好，RSD為1.27%(n=5)；24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD為0.84%(n=5)；平均回收率為99.76%，峰面積的RSD值為0.50%(n=5)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為藥食同源原料小茴香的開發(fā)利用及相關(guān)產(chǎn)品的研究提供了科學(xué)依據(jù)。