馬雪，李楊，王成法，張金鳳

(1.綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院，黑龍江 綏化 152061；2.黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司，黑龍江 綏化 152000)

我國是真正的玉米淀粉生產(chǎn)大國，目前國內(nèi)都是采用濕法來制備淀粉，市面上80%以上的淀粉都是以玉米為原料生產(chǎn)的[1]。每年生產(chǎn)玉米淀粉的同時(shí)也會(huì)有大量的玉米浸泡液產(chǎn)出，玉米浸泡濃縮液也稱玉米漿，是玉米濕法加工生產(chǎn)淀粉時(shí)的一種主要副產(chǎn)物。玉米漿中蛋白質(zhì)含量很高[2]，在實(shí)際應(yīng)用中通常采用噴霧干燥的方法制成干粉加到飼料中，或者直接作為“三廢”處理和排放掉[3]，若能對玉米漿中的蛋白質(zhì)成分進(jìn)一步開發(fā)利用，可大大提高玉米加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

利用酶法對玉米蛋白進(jìn)行水解生產(chǎn)玉米肽具有高安全性、高效性等特點(diǎn)[4,5]，而且，對玉米肽進(jìn)行的研究表明：與玉米蛋白相比，玉米肽具有良好的溶解性，能夠在較大pH范圍內(nèi)完全溶于水，無渾濁、沉淀現(xiàn)象[6]，具有高濃度、低粘度等功能特性，可應(yīng)用于開發(fā)復(fù)合調(diào)味汁或高蛋白流體食品；還具有易消化吸收、促進(jìn)微生物發(fā)酵、抗氧化活性等特性，可以作為生產(chǎn)醬油、酸奶、發(fā)酵火腿等發(fā)酵食品的添加劑；另外，還可以利用其抗疲勞、促進(jìn)乙醇代謝等活性[7]，開發(fā)成運(yùn)動(dòng)飲料、醒酒飲料等功能飲料。所以，玉米肽可以被廣泛地用作保健食品、發(fā)酵調(diào)味食品及其他原料。酶水解法是目前生產(chǎn)活性肽的主要方法[8],是一種不完全的水解，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)酶水解后并不是生成單個(gè)的氨基酸，它的產(chǎn)物是多肽。水解反應(yīng)并沒有如鈉和水反應(yīng)那樣劇烈，非常溫和地進(jìn)行，而且反應(yīng)很快、效率非常高，因?yàn)楫a(chǎn)物是多肽，所以原有的氨基酸沒有任何變化，此法制多肽不需要投入太大的人力、物力，只需將酶與底物混合好、控制好反應(yīng)條件即可，而且反應(yīng)水解很徹底，幾乎沒有殘留，雜質(zhì)也很少。

本研究利用酶法對玉米漿進(jìn)行水解制備多肽，通過不同的酶種類、溫度、時(shí)間、酶與底物比、pH值等單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳酶解工藝，研究結(jié)果對提高玉米漿蛋白的利用價(jià)值和開發(fā)具有生理活性的玉米肽產(chǎn)品具有實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米漿(黑龍江龍鳳玉米有限公司提供)；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；中性蛋白酶(武漢金科天成科技有限公司)；氨基乙酸、水合茚三酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、D-果糖、硼酸、氫氧化鈉、乙醇(均為分析純)；鹽酸(優(yōu)級純)。

1.2 儀器設(shè)備

PHBJ-260型便攜式pH計(jì) 合肥卓爾儀器儀表有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋 金壇市岸頭國瑞實(shí)驗(yàn)儀器廠；離心機(jī) 湖南星科科學(xué)儀器有限公司；PL203型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；SH220石墨消解儀、K9840自動(dòng)凱氏定氮儀 濟(jì)南海力儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

玉米漿需要加熱破壞玉米蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)使其可以被蛋白酶水解。而且試驗(yàn)材料是濕法制玉米淀粉的副產(chǎn)物玉米漿，里面含有其他酶類。因此，本試驗(yàn)采用熱處理即沸水浴30 min使玉米漿蛋白變性并且使其他雜酶失活，避免其影響試驗(yàn)。

1.3.2 原料中蛋白質(zhì)的含量測定

利用凱氏定氮法測定原料中蛋白質(zhì)的含量。主要目的是確定試驗(yàn)不同酶與底物比時(shí)酶的用量。

1.3.3 蛋白質(zhì)水解度的測定[9]

用甘氨酸做標(biāo)準(zhǔn)氨基酸并配制合適濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)做空白試驗(yàn)，在分光光度計(jì)570 nm處測定吸光度A值。以甘氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取水解后的樣品液0.1 mL于100 mL容量瓶中并且定容，然后從容量瓶中取0.40 mL試液于具塞比色管中，然后加入1.0 mL指示劑和1.6 mL蒸餾水，混勻，加熱滅酶，冷卻后加入5 mL的40%乙醇溶液，混勻后放置15 min，同時(shí)做空白試驗(yàn)，于570 nm處測定A值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可知水解液中-NH2基的含量。

水解度：DH(%)=h/htot×100%=(水解液中-NH2基的含量-水解前-NH2基的含量)×100%/htot。

式中：h為每1 g水解物中被裂解的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g protein)；htot為每1 g原料蛋白質(zhì)中總的肽鍵毫摩爾數(shù)(mmol/g protein)，玉米蛋白的htot為9.2。

1.3.4 不同酶對玉米漿蛋白水解度影響的研究

稱取經(jīng)預(yù)處理的玉米漿4份，每份15 g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為32%，按酶與底物比3%(W/W，底物重量按蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì))的添加量依次添加堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)pH、溫度至各種酶理論最適值，酶解4 h后，加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算水解度。選出水解度最高的酶作為試驗(yàn)用酶。

1.3.5 中性蛋白酶水解條件的確定

1.3.5.1 pH對水解度的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為32%，分別加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì))，5份玉米漿pH值在6.5～8.5之間平均相差0.5，在50 ℃下反應(yīng)4 h后，加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算水解度。

1.3.5.2 酶與底物比對水解度的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為32%，5份樣品按酶與底物比(E/S)從1.5%開始遞增至4.0%，相鄰樣品差值為0.5%加入中性蛋白酶，并用NaOH溶液把玉米漿pH調(diào)節(jié)到7.5，在50 ℃下反應(yīng)4 h后，加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算水解度。

1.3.5.3 時(shí)間對水解度的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為32%，分別加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì))，調(diào)整玉米漿pH值至7.5，在50 ℃下水解，5份樣品反應(yīng)時(shí)間在2～6 h之間，每隔1 h取1個(gè)樣品加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算水解度。

1.3.5.4 溫度對水解度的影響

稱取經(jīng)預(yù)處理的玉米漿5份，每份15 g，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為32%，分別加入中性蛋白酶3%(W/W，底物重量按蛋白質(zhì)質(zhì)量計(jì))，并用NaOH溶液把玉米漿pH調(diào)節(jié)到7.5，5份溶液的水解溫度分別在40～60 ℃之間平均相差5 ℃，反應(yīng)4 h后加熱滅酶10 min，于3000 r/min離心10 min，然后按1.3.3中樣品檢測方法操作，測定吸光度值A(chǔ)，計(jì)算水解度。

1.3.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取單因素試驗(yàn)結(jié)果分析中的顯著因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳酶解條件，試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對玉米漿蛋白水解度影響的研究

通過對4種不同酶的水解度進(jìn)行測定，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶對玉米漿蛋白的水解度分別為28.67%，36.17%，24.12%，18.43%。由水解度結(jié)果可知，中性蛋白酶的水解度最高，最終選擇中性蛋白酶作為制備玉米肽的水解酶。

2.2 中性蛋白酶水解條件的確定

2.2.1 pH對玉米漿蛋白水解度的影響

pH對玉米漿蛋白水解度的影響結(jié)果見圖1。

圖1 pH對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖1可知，水解度達(dá)到最大值41.7%時(shí)溶液pH為7.5。在pH超過7.5后水解度一直在減少，由此可知所用蛋白酶的活力最高pH值為7.5，pH值大于或者小于7.5都會(huì)影響到中性蛋白酶的活力，從而影響到中性蛋白酶對玉米漿的水解效果。

2.2.2 酶與底物比對玉米漿蛋白水解度的影響

酶與底物比對玉米漿蛋白水解度的影響結(jié)果見圖2。

圖2 酶與底物比對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖2可知，酶與底物比為1.5%時(shí)水解度最低，之后水解度開始增加，而且其水解度達(dá)到較大的峰值32.4%時(shí)酶與底物比為3.0%，當(dāng)酶與底物比大于3%時(shí)，隨著酶與底物比進(jìn)一步提高，其水解度上升趨勢非常小甚至不再增加。因?yàn)楫?dāng)酶與底物比較低時(shí)，酶與所有底物結(jié)合，反應(yīng)速度隨著酶與底物比的升高而增加，酶與底物比較高時(shí)，底物量相對就少，因此多余的酶不能與玉米漿蛋白底物結(jié)合，水解度隨著酶與底物比的增大而緩慢上升直至達(dá)到平衡。從生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，酶與底物比3%時(shí)為最佳，水解效率高且節(jié)約用酶量。

2.2.3 時(shí)間對玉米漿蛋白水解度的影響

時(shí)間對玉米漿蛋白水解度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 時(shí)間對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖3可知，玉米漿蛋白水解度在5 h前一直在增加，在5 h后水解度增幅很小，達(dá)到峰值35.5%，5 h和6 h后水解度值幾乎沒有變化。這是因?yàn)? h后底物蛋白幾乎被水解完全，因此水解度也就幾乎不再增加，從生產(chǎn)成本和經(jīng)濟(jì)效益方面考慮，5 h為最佳水解時(shí)間。

2.2.4 溫度對玉米漿蛋白水解度的影響

溫度對玉米漿蛋白水解度的影響結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對玉米漿蛋白水解度的影響

由圖4可知，在溫度升高時(shí)水解度也隨之增加，玉米漿蛋白水解度在55 ℃時(shí)達(dá)到最高值38.6%，然后隨著溫度升高而逐漸降低。這是因?yàn)橹行缘鞍酌冈跍囟壬叩矫富盍ψ罡叩臏囟葧r(shí)水解效率最高，大于或者小于這個(gè)溫度就會(huì)使酶的活性降低，從而使玉米漿蛋白水解度變低，因此最佳水解溫度為55 ℃。

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)因素水平表進(jìn)行的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 中性蛋白酶水解玉米漿正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù) 表

通過極差分析，各因素影響水解度的順序?yàn)镃>B>D>A，即時(shí)間影響最明顯，酶與底物比次之，然后是溫度，影響最小的是pH值，由K值分析得最好的水平搭配是A2B2C3D2。通過驗(yàn)證試驗(yàn)得到水解度為44.5%，大于其他水解值結(jié)果，即采用中性蛋白酶水解玉米漿的最佳條件是溫度55 ℃、pH值7.5、酶與底物比3%(W/W)、水解時(shí)間6 h。在此條件下，中性蛋白酶水解玉米蛋白粉的水解度最高可達(dá)到44.5%。

3 結(jié)論

通過對不同酶、pH值、溫度、時(shí)間、酶與底物比的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定酶法制備玉米漿蛋白的最佳酶解工藝，由試驗(yàn)得到結(jié)論：以水解度為指標(biāo)，中性蛋白酶對玉米漿蛋白水解度的影響較大，當(dāng)中性蛋白酶與底物玉米漿中蛋白質(zhì)質(zhì)量比為3%、溫度為55 ℃、pH值為7.5的條件下水解6 h時(shí)，玉米漿蛋白水解度最高可達(dá)到44.5%，此時(shí)酶解效果最好。該研究為玉米漿原料的再利用提供了一定的理論基礎(chǔ)，為玉米肽的生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。