吳金松，馬志偉，陳光靜，陳曉培，劉俊桃，張荷麗*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學院，鄭州 450046；2.西南大學 食品科學學院，重慶 400715)

甘蔗(Saccharumofficinarum)屬草本植物禾本科，有薯蔗、糖稈、甜棒兒等別稱，甘蔗稈直立高3～5 m，根狀莖粗壯發(fā)達且多汁，是一年生或多年生的草本植物，普遍分布在熱帶和亞熱帶地域，在我國主要分布在兩廣、貴州等地區(qū)[1]。甘蔗中富含多種糖類、蛋白質(zhì)、維生素(B1,B2,B6)、蔗脂、鈣、磷、鐵、植物甾醇、氨基酸等營養(yǎng)成分[2]。由于甘蔗是生產(chǎn)食糖的主要原料，每年的制糖工業(yè)會產(chǎn)生大量的甘蔗廢渣，如處理不當不但會引起資源浪費，同時也會造成環(huán)境污染[3]。甘蔗渣中富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及多糖酚類等活性成分，其目前用途主要在燃料、造紙工業(yè)、木材、糖發(fā)酵、飼料、微生物培養(yǎng)基等方面，而關(guān)于甘蔗渣中活性多糖的提取純化、活性研究報道較少[4-9]。趙毅[10]發(fā)現(xiàn)從甘蔗渣中以及制糖中提取出的糖蜜內(nèi)，含有對小鼠艾氏癌和肉瘤-180有抑制作用的活性多糖物質(zhì)。因此，探究甘蔗渣中的水溶性多糖提取工藝對于甘蔗渣資源的再利用具有重要意義。

活性多糖的分離提取工藝通常包括酸堿水解法、溶劑提取法、酶解法以及物理強化輔助提取法(超聲波、微波輔助提取)等[11-13]。肖亞聰?shù)萚14]通過比較不同的甘蔗渣多糖提取工藝，綜合分析對比得出酶解法比水提法的得率高，并且提取時間短，但是酶法輔助提取會引入蛋白酶等雜質(zhì)，不利于后續(xù)的分離純化；陳興興等[15]通過超聲波提取法對甘蔗渣多糖的提取工藝進行研究，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝，超聲波輔助提取法的原理是根據(jù)超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應(yīng)，從而加快植物細胞中有效成分的溶出，但是極易造成甘蔗渣大分子多糖結(jié)構(gòu)的破壞。本文采用水提醇沉法提取甘蔗渣中水溶性粗多糖，首先探究了不同單因素(例如提取溫度、提取時間、水料比、乙醇終濃度等)對多糖提取率的影響，結(jié)合正交試驗優(yōu)化，確定甘蔗渣水溶性粗多糖較佳的提取工藝條件，為工業(yè)化提取甘蔗渣多糖在功能食品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

紫皮甘蔗 鄭州市中牟萬邦果蔬批發(fā)市場；無水乙醇 新鄉(xiāng)市三偉消毒制劑有限公司；葡萄糖標品 天津基準化學試劑有限公司；硫酸 洛陽昊華化學試劑有限公司；苯酚 天津市永大化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA3204B分析天平(感量0.0001 g) 上海精科天美科學儀器有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；101-1型電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司； BJ-150多功能粉碎機 德清拜杰電器有限公司；Hanon i2可見光分光光度計 濟南海能儀器股份有限公司；TU-1901雙光束紫外可見光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘蔗渣水溶性粗多糖提取工藝流程

1.3.1.1 去皮、榨汁(收集甘蔗渣)、烘干、粉碎、過篩

先將新鮮的紫皮甘蔗 刮去外皮(留皮會影響粉碎效果)，然后除去甘蔗汁，收集的甘蔗渣經(jīng)漂燙后放入干燥箱中60 ℃烘干，再用粉碎機將其粉碎，并過60目篩后，放置于密封袋中常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 水提

將稱好的甘蔗渣粉放入不同料液比蒸餾水的燒杯中，放入恒溫水浴鍋中，在設(shè)定不同溫度和時間的提取條件下浸提，提取過程要用玻璃棒不斷進行攪拌，避免甘蔗渣粉粘黏燒杯壁而影響浸提效果。

1.3.1.3 離心分離(或抽濾分離)

水提完成后，將其從水浴鍋中取出冷卻后分離上清液與沉淀。再以同樣的水提條件將沉淀重復(fù)浸提，過濾后丟棄沉淀物，將2次的上清液歸并在一起。

1.3.1.4 上清液濃縮

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(轉(zhuǎn)速90 r/min，極限真空度0.1 MPa，55 ℃)或蒸餾裝置蒸餾濃縮，將上清液濃縮至剩余10～20 mL。

1.3.1.5 醇沉

將濃縮后的提取液緩慢加入，與一定比例4 ℃的無水乙醇混合(形成不同的乙醇終濃度)，然后放置于4 ℃的冰箱中靜止12 h左右，會有白色物質(zhì)從溶液中沉淀出來，將沉淀物與上清液抽濾分離，收集沉淀，將沉淀物置于60 ℃的恒溫干燥箱中干燥。

1.3.2 甘蔗渣粗多糖不同提取條件的單因素試驗

參考相關(guān)文獻[16,17]，最終采用水提醇沉法，影響甘蔗渣粗多糖提取的主要因素有提取時間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)和乙醇醇沉濃度等。本試驗以料液比、乙醇醇沉終濃度(%)、提取溫度(℃)和提取時間(h)為單因素條件，探究其對甘蔗渣粗多糖提取率的影響。

1.3.2.1 不同提取時間(h)對甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取 5 g 甘蔗渣粉，固定料液比1∶30→在80 ℃的恒溫水浴鍋中分別浸提1,2,3,4,5 h(各水提2次)→真空抽濾出上清液→歸并2次抽濾的上清液→將上清液濃縮→再以70%的乙醇終濃度沉淀12 h→最后測定甘蔗渣粗多糖的提取率。

1.3.2.2 不同料液比對甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取5 g甘蔗渣粉，選取不同的料液比(分別為1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50)→在80 ℃的恒溫水浴鍋中提取2 h(各水提2次)，后續(xù)試驗方法同1.3.2.1。

1.3.2.3 不同提取溫度對甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取5 g甘蔗渣粉→固定料液比為1∶30→在不同提取溫度(分別為60,70,80,90,100 ℃)的恒溫水浴鍋中提取2 h(各水提2次)，后續(xù)試驗方法同1.3.2.1。

1.3.2.4 不同乙醇終濃度對甘蔗渣中粗多糖提取率的影響

稱取5 g甘蔗渣粉→固定料液比為1∶30、提取溫度設(shè)定為80 ℃、提取時間為2 h(各水提2次)→真空抽濾上清液→歸并2次抽濾的上清液→濃縮上清液→選取乙醇終濃度分別為50%,60%,70%,80%,90%進行沉淀，靜置12 h→最后測定粗多糖的提取率。

1.3.3 甘蔗渣中粗多糖提取工藝的正交試驗[18]

為了確定從甘蔗渣中提取多糖的最佳工藝條件，綜合比較各單因素對甘蔗渣粗多糖提取率影響的試驗結(jié)果，選定提取次數(shù)為2次浸提，以提取溫度、提取時間、料液比、乙醇終濃度為正交試驗優(yōu)化的4個單因素，進行以上四因素三水平的正交試驗設(shè)計L9(34)。試驗不同因素水平和具體安排見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor-level table

1.3.4 甘蔗渣粗多糖提取率的測定

1.3.4.1 葡萄糖含量標準曲線的繪制

采用硫酸-苯酚法[19-21],取10 g左右的葡萄糖放置于105 ℃的干燥箱中烘至恒重，干燥器中冷卻后準確稱量0.100 g，用蒸餾水溶解后定容到100 mL的棕色容量瓶中，配制成葡萄糖儲備液(濃度為1.0 mg/mL)，從儲備液中精確吸取5 mL于50 mL的棕色容量瓶中，加蒸餾水至定容刻度線，得到濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖供試液。再配制濃度為5%的無水苯酚溶液(用移液管精確移取50 mL苯酚溶液到1000 mL容量瓶中并定容至刻度線，放入棕色瓶中避光保存?zhèn)溆?。備好潔凈干燥的試管，用移液管分別準確移取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL的0.1 mg/mL供試液至試管中，按序加入蒸餾水使總體積達到1.0 mL。再加入1 mL 5%的苯酚溶液充分混勻后，迅速加入5 mL的濃硫酸，立即震蕩混勻(做3組平行)，靜止30 min。以空白試液(1 mL蒸餾水+1 mL苯酚+5 mL濃硫酸)為參比，用可見光光度計于室溫下測定490 nm處的吸光值。根據(jù)所測溶液的吸光值繪制線性回歸方程，再根據(jù)標準曲線方程計算出多糖水解液中的總糖含量(μg/mL)。

1.3.4.2 甘蔗渣粗多糖提取率的測定

將抽提低溫鼓風干燥過的甘蔗渣粗多糖沉淀物于250 mL容量瓶中用蒸餾水溶解，定容到標線后搖勻。然后用移液管分別精確吸取2 mL溶液，定容至50 mL的容量瓶中倒轉(zhuǎn)晃動，使溶液混合均勻。然后從中量取1 mL甘蔗渣粗多糖溶液，依次加入1 mL的5%苯酚溶液混勻，迅速加入5 mL的濃硫酸，搖勻后靜止30 min。以空白試液做參比，用可見光光度計于室溫下測定490 nm處的吸光值。參照總糖含量標準曲線繪制方程，將吸光度值代入線性回歸方程可計算出甘蔗渣粗多糖的濃度C。甘蔗渣粗多糖提取率的計算公式如下：

式中：C為樣品葡萄糖濃度(μg/mL)；V為甘蔗渣多糖溶液總體積(mL)；D為稀釋倍數(shù)；M為甘蔗粉質(zhì)量(g)。

1.3.5 甘蔗渣粗多糖的紫外全波段掃描

取干燥后的甘蔗渣粗多糖，配制成0.5 mg/mL的粗多糖溶液，于紫外分光光度計上進行全波段掃描(190～400 nm)[22]。

1.3.6 試驗數(shù)據(jù)分析方法

利用正交優(yōu)化軟件和SPSS 19.0軟件進行相關(guān)數(shù)據(jù)的分析與處理，使用Origin 8.7和Excel 2007進行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗渣粗多糖總糖含量標準曲線

按照葡萄糖濃度和測得的吸光度計算出線性回歸方程為y=0.0103x-0.0192, R2=0.9996，總糖含量的標準曲線見圖1。

圖1 甘蔗渣粗多糖標準曲線Fig.1 The standard curve of bagasse polysaccharides

2.2 單因素試驗對甘蔗渣粗多糖提取率的影響

2.2.1 不同提取時間對甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖2 不同提取時間對甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.2 The effect of different extraction time on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖2可知，隨著提取時間不斷增加，甘蔗渣粗多糖不斷溶解于水中，提取率也隨之提高，提取時間在1～5 h內(nèi)時提取率增加顯著，所以為提高提取效率和節(jié)約成本，應(yīng)選定時間為2,3,4 h 3個水平進行正交試驗為宜。

2.2.2 不同料液比對甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖3 不同料液比對甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.3 The effect of different material-liquid ratios on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖3可知，在料液比1∶10～1∶30范圍內(nèi)，甘蔗渣粗多糖的提取率隨料液比的增長而逐步增長，且增長趨勢十分顯著。在料液比增加至1∶30后提取率呈下降趨勢，可能是因為當料液比過高時，甘蔗渣中的其他雜質(zhì)成分也都溶析出來，導致提取率的降低。但是當料液比為1∶10時提取率最低，可能由于在提取溶劑用量較少時，甘蔗渣多糖沒有充分溶解，也不利下一步抽濾。此外，料液比例過高時，浸提體系的總體積增加，導致后續(xù)濃縮工藝的成本增加，為提高提取工藝效率，選擇1∶20,1∶30,1∶40 3個水平的料液比進行后續(xù)正交試驗。

2.2.3 不同提取溫度對甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖4 不同提取溫度對甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.4 The effect of different extraction temperatures on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖4可知，隨著提取溫度的不斷升高，甘蔗渣粗多糖的提取率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在60～80 ℃水提溫度下，提取率隨溫度的上升而增加，水提溫度在80 ℃左右時提取率達到最大，但在80～100 ℃時呈下降趨勢，可能是因為溫度較高引起破壁效應(yīng)加劇導致多糖分解，進而提取率也隨之下降，所以選擇提取溫度的3個水平70，80，90 ℃進行正交試驗為宜。

2.2.4 不同乙醇終濃度對甘蔗渣粗多糖提取率的影響

圖5 不同乙醇終濃度對甘蔗渣粗多糖提取率的影響Fig.5 The effect of different final ethanol concentration on the extraction rate of crude polysaccharides from bagasse

由圖5可知，隨著乙醇最終沉淀濃度的不斷提升，甘蔗渣粗多糖的提取率不斷增加，且增加顯著，所以選擇乙醇最終沉淀濃度為70%，80%，90%進行后續(xù)的正交試驗。

2.3 水提醇沉法提取甘蔗渣粗多糖試驗結(jié)果

正交試驗優(yōu)化甘蔗渣粗多糖的提取工藝試驗數(shù)據(jù)見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

由表2可知，4個單因素對結(jié)果的影響程度為B>A>C>D，即影響要素的關(guān)系依次排序為乙醇終濃度>料液比>提取溫度>提取時間，提取時間的影響不顯著，綜合提取率和提取效率考慮，得出最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即最佳提取工藝條件為料液比1∶30，乙醇終沉淀濃度90%，水提溫度70 ℃，水提時間3 h。在此提取條件下，甘蔗渣粗多糖的提取率為 1.03%。

2.4 甘蔗渣粗多糖的紫外吸收曲線

圖6 甘蔗渣粗多糖溶液的紫外掃描圖譜Fig.6 Ultraviolet spectrum of crude polysaccharides solution from bagasse

由圖6可知，在波長190～400 nm范圍內(nèi)，甘蔗渣粗多糖溶液經(jīng)過紫外吸收掃描后， 在260～280 nm 處均無明顯的吸收峰，說明其不含或含有極少量的核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

3 結(jié)論

通過水提醇沉法，結(jié)合單因素試驗和正交試驗優(yōu)化，得出甘蔗渣中水溶性多糖的最佳提取工藝條件為：料液比1∶30，乙醇終沉淀濃度90%，水提溫度70 ℃，水提時間3 h。在此提取條件下，甘蔗渣粗多糖的提取率為 1.03%。通過對甘蔗渣粗多糖溶液的紫外掃描，在260～280 nm 處均無明顯吸收峰，進一步說明了該提取工藝條件的可靠性。提取到的甘蔗渣粗多糖有待于進一步的純化，為甘蔗渣多糖的活性探究和結(jié)構(gòu)鑒定打下堅實的基礎(chǔ)。