沈瑞玲，王彥平，呼紅梅，李廣立，王繼英，成建國

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100；2.山東春藤食品有限公司棗莊黑蓋豬原種豬場，山東 棗莊 277100）

豬的脊椎包括頸椎、胸椎、腰椎、薦椎和尾椎五部分，其中不同豬的胸椎和腰椎數(shù)存在著差異，其中胸椎數(shù)為14～16根，腰椎數(shù)則為5～7根。豬脊椎數(shù)的差異與胴體長和產(chǎn)肉量有關(guān)，脊椎數(shù)偏多的個(gè)體相對(duì)一般個(gè)體體型大、產(chǎn)肉性能高。西方商業(yè)豬種對(duì)與脊椎數(shù)相關(guān)的體長、胴體長等性狀進(jìn)行了高強(qiáng)度的人工選擇，從而使得西方商業(yè)豬種在選育的過程中胸腰椎數(shù)也隨之增加。野豬及中國大部分地方豬種的胸腰椎總數(shù)為19根，但是歐洲商業(yè)豬種卻達(dá)到21～23根。

脊椎數(shù)的變異主要受遺傳的影響，具有較高的遺傳力[1]。研究人員開展了一系列的研究，揭示影響豬脊椎骨的主效基因有2個(gè)，其中一個(gè)為位于1號(hào)上的NR6A1基因，該基因第192個(gè)氨基酸由脯氨酸突變成亮氨酸（Pro192Leu）的突變位點(diǎn)為1號(hào)染色體上影響腰椎數(shù)的因果突變位點(diǎn)[2]。另一個(gè)為VRTN基因，該基因一段291 bp的插入序列可能通過加快胚胎期脊椎分化增加胸椎的數(shù)量，而且該基因突變具有“一因多效”性，增加肋骨數(shù)的同時(shí)增加乳頭數(shù)、體長和產(chǎn)肉量，非常適合中西方豬種的遺傳改良[3-4]。

棗莊黑蓋豬是山東省棗莊市存養(yǎng)歷史悠久的一個(gè)地方豬群體，具有繁殖率高、哺育力強(qiáng)、肉質(zhì)細(xì)嫩，耐粗抗病、適應(yīng)力強(qiáng)等特性，無論從育種還是市場開發(fā)方面，棗莊黑蓋豬都具有良好的開發(fā)利用前景。影響脊椎數(shù)的這兩個(gè)候選基因有利基因型在棗莊黑蓋豬群體中遺傳多態(tài)性如何呢？本研究針對(duì)棗莊黑蓋豬核心群體，利用分子生物學(xué)方法對(duì)NR6A1基因c.575 G＞A突變位點(diǎn)和VRTN基因291 bp序列插入突變進(jìn)行檢測和遺傳分析，為下一步實(shí)施分子標(biāo)記輔助育種，提高棗莊黑蓋豬的體長和產(chǎn)肉量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

棗莊黑蓋豬（N=79）樣本于2017年采自棗莊黑蓋豬保種場。樣本采集時(shí)，選取核心群全部種公豬及有代表性的種豬，取耳組織放入eppendorf離心管中，加入70%酒精，帶回山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行基因組提取和多態(tài)性檢測。

1.2 基因組DNA提取

利用組織/血液/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取試驗(yàn)豬耳組織的基因組DNA。基因組DNA提取后利用NanoDrop檢測DNA的純度和濃度，調(diào)整到濃度為50 ng/μL左右用于PCR擴(kuò)增。

1.3 PCR擴(kuò)增及基因型檢測

1.3.1 引物合成 NR6A1基因引物參考文獻(xiàn)Yang等[5]，上游引物 5'-CATCCTCTTGCCTCCCTTAC-3'，下游引物 5'-ATCCTGAGCACCCAGTCTAAC-3'。VRTN基因引物參考文獻(xiàn)[4]，上游引物5'-GGCAGGG AAGGTGTTTGTT-3'，下游引物 5'-GACTGGCCTCTG TCCCTTG-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 NR6A1和VRTN基因采用相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Mastermix[天根生化科技（北京）有限公司，KT201]10 μL，上、下游引物各 1 μL（20 pmol/μL），50 ng/μL 模板 1 μL，加雙蒸水至 20 μL。反應(yīng)條件為：94℃變性5 min，35次循環(huán)（94℃，30 s；60℃，30 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸 8 min。

1.3.3 基因型檢測 VRTN基因影響胸椎數(shù)是通過一段291 bp的序列插入造成，瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見多態(tài)性。NR6A1基因采用PCR-RFLP進(jìn)行分析，即10 μL PCR產(chǎn)物，1 μL NciI限制性內(nèi)切酶，2.0 μL Buffer，37 ℃水浴 40 min 后，2.5%瓊脂糖電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用 Popgene32 Version 1.32 和 Cervus 3.0.7 軟件對(duì)群體中的計(jì)算基因型頻率、基因頻率、群體遺傳多態(tài)性參數(shù)[包括多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳雜合度（HE）和有效等位基因數(shù)（Ne）等]，并進(jìn)行哈德-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 NR6A1和VRTN基因基因型分析

本試驗(yàn)所擴(kuò)增的NR6A1基因片段長度為360 bp，由于該目的片段184 bp處存在突變位點(diǎn)（A＞G）。其中AA基因型（CCCAG）不被NciI限制性內(nèi)切酶識(shí)別，在瓊脂糖凝膠電泳圖像中呈現(xiàn)1個(gè)條360 bp帶；GG基因型（CCCGG）可被NciI識(shí)別切成183 bp和177 bp 2個(gè)片段，由于這兩個(gè)片段長度接近，在瓊脂糖凝膠電泳的180 bp處呈現(xiàn)1個(gè)條帶；AG基因型的G鏈能被NciI切開而A鏈不能切開，在瓊脂糖凝膠電泳圖像中呈現(xiàn)360 bp和180 bp 2個(gè)條帶。NR6A1基因部分樣本PCR-RFLP電泳圖見圖1。

圖1 NR6A1基因部分樣本PCR-RFLP電泳結(jié)果

VRTN基因通過突變序列有插入造成，瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物即可見檢測多態(tài)性。其中只含有突變序列的目的片段的ins/ins基因型電泳呈現(xiàn)411 bp 1個(gè)條帶，只含有非突變序列的目的片段的-/-基因型電泳呈現(xiàn)120 bp 1個(gè)條帶，同時(shí)含有突變序列和非突變序列的目的片段的ins/-基因型電泳呈現(xiàn)120 bp和411 bp 2個(gè)條帶。VRTN基因部分樣本PCR-RFLP電泳圖見圖2。

圖2 VRTN基因部分樣本PCR電泳結(jié)果

2.2 NR6A1和VRTN基因頻率分析

棗莊黑蓋豬群體中NR6A1和VRTN基因多態(tài)性的檢測結(jié)果詳見表1。從表1可以看出，NR6A1基因有3種基因型，分別為AA基因型、AG基因型和GG基因型，其中AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為 0.455 7，GG 基因型頻率最低為 0.101 3。VRTN基因存在ins/ins、ins/-和-/-3種基因型，其中缺失型基因型（-/-）為優(yōu)勢(shì)基因型，基因型頻率為0.506 3，插入型基因型（ins/ins）頻率最低只有 0.050 6。本研究結(jié)果說明，NR6A1和VRTN基因在棗莊黑蓋豬群體中均存在多態(tài)性，NR6A1基因的有利等位基因A的頻率為0.677 2，VRTN基因的有利等位基因ins頻率為0.272 2，NR6A1和VRTN 基因有利等位基因均存在較大的選育空間。

表1 NR6A1和VRTN基因在棗莊黑蓋豬群體內(nèi)的多態(tài)性分布

2.3 NR6A1和VRTN的遺傳分析

NR6A1和VRTN的遺傳多態(tài)性分析結(jié)果詳見表2。從表2可以看出，NR6A1和VRTN基因突變位點(diǎn)的群體遺傳多態(tài)性參數(shù)值均較高，遺傳多態(tài)性處于中度多態(tài)。而且經(jīng)χ2檢驗(yàn)，NR6A1和VRTN基因的 P 均大于 0.05，NR6A1 基因 c.575 A＞G 位點(diǎn)和VRTN基因插入突變?cè)跅椙f黑蓋豬群體內(nèi)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。群體遺傳多態(tài)性及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明棗莊黑蓋豬以前沒有對(duì)NR6A1和VRTN基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行過選育，這與棗莊黑蓋豬沒有把體長等與脊椎數(shù)相關(guān)的指標(biāo)作為選育目標(biāo)相一致。

表2 棗莊黑蓋豬群體中NR6A1和VRTN基因突變位點(diǎn)多態(tài)性參數(shù)

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用PCR-RFLP和PCR方法對(duì)棗莊黑蓋豬的NR6A1 c.575 A＞G位點(diǎn)和VRTN基因291 bp序列插入進(jìn)行多態(tài)性檢測，棗莊黑蓋豬群體中NR6A1基因有AA、AG和GG 3種基因型，對(duì)提高脊椎數(shù)有利的AA基因型頻率為0.455 7；VRTN基因存在ins/ins、ins/-和-/-3種基因型，對(duì)提高脊椎數(shù)有利的插入型基因型（ins/ins）頻率最低只有0.050 6；這兩個(gè)基因在棗莊黑蓋豬群體內(nèi)為中度多態(tài)，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。我們的研究結(jié)果表明以前沒有對(duì)棗莊黑蓋豬NR6A1和VRTN基因的突變位點(diǎn)進(jìn)行過選育，建議利用標(biāo)記輔助選擇快速提高這兩個(gè)基因的有利基因型頻率，從而增加黑蓋豬群體的脊椎數(shù)，增加胴體長，提高產(chǎn)肉量。