常淑芬

【摘 要】長(zhǎng)期以來(lái)，棉花深受蟲(chóng)害影響，導(dǎo)致棉花減產(chǎn)。隨著分子生物學(xué)及重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將外源殺蟲(chóng)基因?qū)朊藁ǐ@得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉已成為解決棉花蟲(chóng)害的手段之一。本文綜述了常用外源殺蟲(chóng)基因的種類、殺蟲(chóng)機(jī)理及在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，并探討了抗蟲(chóng)棉遇到的一些問(wèn)題及今后的發(fā)展趨勢(shì)。

【關(guān)鍵詞】基因工程；抗蟲(chóng)棉；抗蟲(chóng)基因；研究進(jìn)展

【中圖分類號(hào)】S332.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】2095-3089（2018）22-0048-02

棉花不僅是一種重要的紡織原料，也是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。長(zhǎng)期以來(lái)棉花深受棉鈴蟲(chóng)、棉紅鈴蟲(chóng)、甜菜夜蛾、玉米螟、蚜蟲(chóng)等多種害蟲(chóng)的侵害，其中以棉鈴蟲(chóng)等鱗翅目害蟲(chóng)的危害最為嚴(yán)重。據(jù)調(diào)查顯示上世紀(jì)90年代，棉鈴蟲(chóng)連年爆發(fā)，每年給國(guó)家造成的經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)幾十億甚至幾百億。已成為限制棉花生產(chǎn)的重要因素。為了有效地防治棉鈴蟲(chóng)等害蟲(chóng)，通過(guò)各種技術(shù)手段培育抗蟲(chóng)棉具有重要意義。其中利用基因工程培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是目前解決棉花蟲(chóng)害的一種主要方法。

一、常用的外源殺蟲(chóng)基因

一些微生物或動(dòng)植物體內(nèi)能產(chǎn)生殺死昆蟲(chóng)的毒蛋白，將這些毒蛋白基因?qū)氲矫藁ㄖ?，可賦予棉花抗蟲(chóng)性。按導(dǎo)入的外源殺蟲(chóng)蛋白基因分類，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉有Bt抗蟲(chóng)棉、蛋白酶抑制劑抗蟲(chóng)棉、外源凝集素抗蟲(chóng)棉等。目前，在生產(chǎn)中應(yīng)用最多的主要是Bt抗蟲(chóng)棉。

1.蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白基因（Bt基因）。

蘇云金芽孢桿菌是一類廣泛存在于自然界的革蘭氏陽(yáng)性菌，代謝過(guò)程中能產(chǎn)生殺蟲(chóng)晶體蛋白、δ-外毒素、β-外毒素等，主要對(duì)鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目等害蟲(chóng)有毒害作用，研究還發(fā)現(xiàn)Bt對(duì)寄生線蟲(chóng)、絳蟲(chóng)等也有影響，但對(duì)人畜無(wú)毒害作用，因此在有害生物的治理中起著非常重要的作用。

2.蛋白酶抑制劑基因。

蛋白酶抑制劑在植物中廣泛存在，尤其在植物的種子中含量豐富，約占植物總蛋白的10%。迄今為止，蛋白酶抑制劑根據(jù)作用酶的活性位點(diǎn)的不同和氨基酸序列的同源性，分為4類：絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制劑分為Bowman-birk型、Kunitz型、PI-I型、PI-II型等，其中Bowman-birk型中的豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（CpTI）和大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因（SKTI）對(duì)鱗翅目、鞘翅目、直翅目等多數(shù)農(nóng)田害蟲(chóng)都有毒殺作用，在轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中最為廣泛。其殺蟲(chóng)機(jī)理是：CpTI能與害蟲(chóng)消化道內(nèi)的蛋白消化酶緊密結(jié)合形成酶-抑制復(fù)合物，使害蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白消化酶被抑制，當(dāng)害蟲(chóng)取食轉(zhuǎn)CpTI的植物時(shí)，就會(huì)抑制生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至死亡；同時(shí)，當(dāng)CpTI與害蟲(chóng)體內(nèi)的蛋白消化酶結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致害蟲(chóng)體內(nèi)蛋白酶的過(guò)量分泌，經(jīng)過(guò)神經(jīng)系統(tǒng)的反饋調(diào)節(jié)，使害蟲(chóng)產(chǎn)生厭食反應(yīng)。上述雙重效應(yīng)將減少昆蟲(chóng)對(duì)植物蛋白的攝取及利用率，最終造成昆蟲(chóng)因缺少必要的蛋白質(zhì)而停止發(fā)育甚至死亡[3]。由于CpTI對(duì)人畜沒(méi)有毒害作用，因而在轉(zhuǎn)基因中有很好的應(yīng)用前景。

3.外源凝集素基因。

外源凝集素是一類能特異識(shí)別并可逆地結(jié)合單糖或寡糖的蛋白或糖蛋白。在植物各組織器官中均有發(fā)現(xiàn)，尤以豆科植物的種子中含量最為豐富。目前人們已分離出多種外源凝集素，但大多數(shù)外源凝集素因?qū)Ω叩葎?dòng)物有毒害作用，從而限制了它們?cè)诨蚬こ谭矫娴膽?yīng)用。其中雪花蓮凝集素基因（GNA）對(duì)刺吸式和咀嚼式害蟲(chóng)有毒性，可以抑制害蟲(chóng)的生長(zhǎng)甚至抑制其繁殖力，并且對(duì)其天敵、人畜等無(wú)害，在植物抗蟲(chóng)基因工程方面正日益受到重視。

4.新型抗蟲(chóng)基因。

除以上幾種主要的抗蟲(chóng)基因外，昆蟲(chóng)神經(jīng)毒素、淀粉酶抑制劑、幾丁質(zhì)酶基因、陰離子過(guò)氧化物酶基因、核糖體失活蛋白基因、脂肪氧化酶基因等一些新的抗蟲(chóng)基因正在被研究。

二、轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉存在的問(wèn)題

盡管轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉在控制害蟲(chóng)方面取得了很大的進(jìn)展，但在生產(chǎn)實(shí)踐中仍存在一些局限性，在實(shí)踐中也遇到了一些問(wèn)題。

1. 抗蟲(chóng)譜較窄，害蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性。

危害棉花的害蟲(chóng)有幾百種，其中主要以棉鈴蟲(chóng)、棉蚜、棉葉螨、斜紋夜蛾、棉紅鈴蟲(chóng)的危害最為嚴(yán)重。目前世界各國(guó)培育和應(yīng)用的大多是Bt轉(zhuǎn)基因棉，這種抗蟲(chóng)棉僅對(duì)棉鈴蟲(chóng)、棉紅鈴蟲(chóng)等極少數(shù)鱗翅目害蟲(chóng)有抗性，對(duì)其他害蟲(chóng)不具有抗性。相反還增加了其他害蟲(chóng)的發(fā)生率，使一些次要害蟲(chóng)上升為主要的害蟲(chóng)。Wu等的研究表明，Bt轉(zhuǎn)基因棉雖然減少了棉鈴蟲(chóng)的數(shù)量，但是并沒(méi)有減少蚜蟲(chóng)、盲蝽蟓等害蟲(chóng)的數(shù)量，Men等的研究則表明，Bt棉田的次要害蟲(chóng)盲蝽蟓可能比非轉(zhuǎn)基因棉田的數(shù)量多。目前由于昆蟲(chóng)動(dòng)態(tài)數(shù)量的變化而導(dǎo)致次要害蟲(chóng)對(duì)棉花生產(chǎn)所造成的損失已成為普遍現(xiàn)象，因此要不斷地研發(fā)抗蟲(chóng)范圍更廣的抗蟲(chóng)基因，培育廣譜性更強(qiáng)的抗蟲(chóng)棉。

2. 外源抗蟲(chóng)基因在棉花受害部位表達(dá)量低。

在目前轉(zhuǎn)基因植物中，驅(qū)動(dòng)外源抗蟲(chóng)基因在植物體內(nèi)的表達(dá)多采用組成型啟動(dòng)子，如CaMV35S啟動(dòng)子，使目的基因在植物體內(nèi)各部位平均表達(dá)，難以在受侵害部位形成較高的作用濃度，害蟲(chóng)在長(zhǎng)期的選擇壓下提高了對(duì)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的抗性幾率。因此有必要研究使外源抗蟲(chóng)基因在轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)特定的時(shí)間及特定的部位高效表達(dá)的方法。

3.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的Bt毒蛋白表達(dá)的時(shí)空性。

（1）轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的Bt毒蛋白表達(dá)具有時(shí)間性。

研究發(fā)現(xiàn)，隨著棉株的生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖組織出現(xiàn)、成熟、衰老，Bt毒蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)，即前期抗蟲(chóng)性強(qiáng)，后期抗蟲(chóng)性弱；而棉鈴蟲(chóng)危害較嚴(yán)重的時(shí)期正處于棉花生長(zhǎng)階段的后期。因此，抗蟲(chóng)棉種植的后期應(yīng)適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行化學(xué)防治，并結(jié)合生物防治，以降低蟲(chóng)害。

（2）轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的Bt毒蛋白表達(dá)具有空間性。

即：棉株不同組織器官抗蟲(chóng)性能存在差異，一般是營(yíng)養(yǎng)器官高于生殖器官，其抗性順序?yàn)楣δ苋~>嫩頂葉>蕾>花。此順序也間接表明棉鈴蟲(chóng)對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的為害有位置效應(yīng)。因此轉(zhuǎn)Bt毒蛋白的抗蟲(chóng)棉在開(kāi)花和成蕾期要結(jié)合化學(xué)防治，治理害蟲(chóng)。

4.標(biāo)記基因的安全性。

目前，常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因和除草劑抗性基因，在轉(zhuǎn)基因棉花中常用的標(biāo)記基因是nptⅡ基因。雖然，nptⅡ基因已通過(guò)安全評(píng)價(jià)，但是其他標(biāo)記基因的使用可能對(duì)生態(tài)環(huán)境和人類健康等存在潛在的威脅，例如一些抗除草劑基因可以通過(guò)花粉、種子等傳播途徑與近緣野生種雜交，使近緣野生種獲得抗除草劑基因，若近緣野生種本身就是雜草，那么就有可能變?yōu)殡y以控制的“超級(jí)雜草”，還可能導(dǎo)致遺傳基因多樣性的丟失。另外，標(biāo)記基因及其產(chǎn)物還可能會(huì)影響人或動(dòng)物的健康。

5.轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉易出現(xiàn)早衰、枯萎病、黃萎病。

轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉在一定程度上實(shí)現(xiàn)了防治害蟲(chóng)的目的，棉鈴脫落也大大減少，棉鈴成鈴高峰期提前，但早熟的同時(shí)，由于體內(nèi)大量的養(yǎng)分被消耗掉，會(huì)出現(xiàn)早衰?？瓜x(chóng)棉發(fā)育過(guò)早，開(kāi)花結(jié)鈴盛期提前，因此，伏桃和早秋桃結(jié)鈴比例較少，早伏桃相對(duì)比例就會(huì)增加，造成抗蟲(chóng)棉早衰。

三、轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的發(fā)展趨勢(shì)

1.增強(qiáng)抗蟲(chóng)基因的抗性，減緩昆蟲(chóng)的耐受性。

（1）優(yōu)化并聯(lián)合使用多價(jià)基因。

對(duì)天然抗蟲(chóng)基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化改造，在一定程度上能提高對(duì)昆蟲(chóng)的抗性。田穎川等采用定點(diǎn)突變法對(duì)雪花蓮凝集素（GNA）進(jìn)行了遺傳修飾，將其含有的稀有密碼子改造成植物常用密碼子，修飾后的GNA轉(zhuǎn)基因棉花與對(duì)照相比對(duì)棉蚜有很好的抑制作用。

（2）RNAi技術(shù)。

近來(lái)，有研究報(bào)道，RNAi技術(shù)對(duì)控制蘋(píng)果淺褐卷葉蛾、吸血椿象、白蟻等多種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)有很好的效果。目前，利用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)還處在試驗(yàn)階段，但利用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)將是值得探討的一條路。

（3）“高劑量或庇護(hù)所”（high dose/refuge）策略。

高劑量或庇護(hù)所是將轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物混種，種植的轉(zhuǎn)基因植物能夠高效表達(dá)抗蟲(chóng)毒素殺死雜合或純合的抗性害蟲(chóng)。而敏感害蟲(chóng)能在非轉(zhuǎn)基因植物（“庇護(hù)所”）上繁殖，這樣通過(guò)敏感害蟲(chóng)與抗性害蟲(chóng)的隨機(jī)交配可以達(dá)到“稀釋”抗性害蟲(chóng)的抗性基因。

2.采用誘導(dǎo)型、組織特異性的啟動(dòng)子提高外源抗蟲(chóng)基因的表達(dá)量。

組織特異性啟動(dòng)子，可以使外源抗蟲(chóng)基因僅在植物的花、生長(zhǎng)點(diǎn)、蕾、葉、鈴等特定部位高效表達(dá)，減緩害蟲(chóng)對(duì)外源抗蟲(chóng)基因產(chǎn)生抗性。損傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，當(dāng)害蟲(chóng)取食植株時(shí)，植株受到損傷，該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源抗蟲(chóng)基因表達(dá)，大量合成殺蟲(chóng)蛋白，在植株受到損傷時(shí)殺蟲(chóng)蛋白在受害部位瞬間大量表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白，能更有效地殺死害蟲(chóng)。這種啟動(dòng)子應(yīng)該對(duì)害蟲(chóng)的為害產(chǎn)生高度反應(yīng)，或者正好在害蟲(chóng)為害前由誘導(dǎo)因子加以調(diào)控，使抗蟲(chóng)基因只有在受到害蟲(chóng)侵襲時(shí)，僅在被害蟲(chóng)侵襲部位高效表達(dá)。這在一定程度上可以降低對(duì)害蟲(chóng)的選擇壓力，延緩轉(zhuǎn)基因作物的抗性壽命。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)啟動(dòng)子的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求，應(yīng)不斷探索更多用于抗蟲(chóng)基因的特異啟動(dòng)子以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的表達(dá)效果。利用時(shí)間和空間特異性啟動(dòng)子，確保外源殺蟲(chóng)蛋白在特定時(shí)間和空間條件下表達(dá)。當(dāng)害蟲(chóng)危害棉花時(shí)，棉花植株受到傷害，誘導(dǎo)啟動(dòng)子高效表達(dá)，合成外源殺蟲(chóng)蛋白，在損傷部位瞬間高效表達(dá)，從而更有效地防治害蟲(chóng)。

3.標(biāo)記基因的安全性策略。

為了避免標(biāo)記基因帶來(lái)的安全性問(wèn)題，近年來(lái)在標(biāo)記基因的使用和選擇方面有了新的進(jìn)展。

例如，無(wú)選擇標(biāo)記基因的安全技術(shù)，該技術(shù)是利用分離剔除和重組剔除等方法將選擇標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)基因植物后代剔除。目前該技術(shù)已在擬南芥、煙草、玉米、水稻等作物中獲得了成功。將該技術(shù)應(yīng)用于煙草，可使外源基因的刪除效率達(dá)100%，但該技術(shù)在大田條件下是否有如此高的刪除效率有待進(jìn)一步的驗(yàn)證[46-47]。而將該技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因棉花生產(chǎn)中將是未來(lái)幾年需要解決的問(wèn)題。此外，開(kāi)發(fā)新的安全標(biāo)記基因，例如綠色熒光蛋白基因（gfp）[48]、葉綠素生物合成酶基因（HemL）[49]、葡萄糖苷酶基因（gus）、異戊稀轉(zhuǎn)移酶基因（Ipt）[50]等，這些基因不產(chǎn)生抗生素和除草劑抗性，避免了標(biāo)記基因引起的轉(zhuǎn)基因植物的安全性問(wèn)題。

4.進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)基因棉花的產(chǎn)量。

Bt轉(zhuǎn)基因棉花能夠殺死害蟲(chóng)，但無(wú)法提高棉花的產(chǎn)量。我國(guó)于2005年成功地選育出了三系雜交抗蟲(chóng)棉新品種“銀棉2號(hào)”，這是我國(guó)第一個(gè)通過(guò)國(guó)家審定的比常規(guī)育種抗蟲(chóng)棉增產(chǎn)26.4%的新品種。并且同時(shí)培育了轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)基因三系雜交棉常規(guī)育種與分子育種相結(jié)合的一種新體系，該體系不僅實(shí)現(xiàn)了棉花的高產(chǎn)、高效，而且成本低。因此，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)雜交棉對(duì)于實(shí)現(xiàn)棉花的高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)具有重要意義。

四、展望

綜上所述，轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉不僅在害蟲(chóng)防治方面起到了一定的作用，還避免了化學(xué)殺蟲(chóng)劑對(duì)環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的破壞，但是目前應(yīng)用于生產(chǎn)中的抗蟲(chóng)棉大多數(shù)仍是Bt棉，隨之而來(lái)也產(chǎn)生了一些新的問(wèn)題，例如：抗蟲(chóng)范圍狹窄、害蟲(chóng)易產(chǎn)生抗性、一些次要害蟲(chóng)轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕οx(chóng)等。許多工作正致力于研究其新型抗蟲(chóng)基因、特異性啟動(dòng)子等，為培育出優(yōu)質(zhì)廣譜性，抗性更持久的抗蟲(chóng)棉奠定基礎(chǔ)，但關(guān)于一些抗蟲(chóng)基因的殺蟲(chóng)機(jī)理、對(duì)人畜、天敵有無(wú)毒性等目前還不是很清楚，因此，深入研究并培育出持久性雙價(jià)抗蟲(chóng)棉或既抗鱗翅目又抗同翅目害蟲(chóng)的多價(jià)抗蟲(chóng)棉，且品質(zhì)優(yōu)良，高產(chǎn)早熟的新品種，是抗蟲(chóng)棉的發(fā)展趨勢(shì)。而開(kāi)發(fā)新的標(biāo)記基因，提高轉(zhuǎn)基因棉的安全性也是今后應(yīng)關(guān)注的重點(diǎn)內(nèi)容。

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