居燕云，劉婷，苗雷英，湯旭娜

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬口腔醫(yī)院/南京市口腔醫(yī)院，江蘇 南京 210008)

牙齒發(fā)育啟動(dòng)來源于口腔上皮分泌的誘導(dǎo)信號(hào)，發(fā)育早期的上皮誘導(dǎo)信號(hào)旁分泌到下方的牙源性間充質(zhì)，激活間充質(zhì)中特定的轉(zhuǎn)錄因子(Msx、Dlx、Pax)，特異性地調(diào)控牙齒發(fā)育的啟動(dòng)過程，從而引導(dǎo)牙齒形態(tài)發(fā)生[1]。小鼠的胚胎發(fā)育僅為20 d左右,在胚胎齡(embryonic day，ED)第11.5天牙齒發(fā)育開始啟動(dòng)，首先在上皮發(fā)生形態(tài)變化，表現(xiàn)為局部的口腔上皮增厚形成牙板并向深層的外胚間充質(zhì)內(nèi)陷。胚胎發(fā)育第13.5天時(shí)，牙板上皮增生形成圓形或卵圓形的上皮芽，此上皮階段稱為蕾狀期成釉器，此時(shí)成釉器內(nèi)上皮細(xì)胞未見分化，其周圍的外胚間充質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)聚集，包繞在上皮芽周圍。胚胎發(fā)育至14.5 d時(shí)，成釉器呈現(xiàn)帽狀，成釉器內(nèi)的細(xì)胞開始出現(xiàn)分層，形成內(nèi)釉上皮層、外釉上皮層和星網(wǎng)狀層，而成釉器下方密集的外胚間充質(zhì)細(xì)胞仍未出現(xiàn)分化[2]。當(dāng)牙胚進(jìn)入16～19 d時(shí)，成釉器形成鐘狀結(jié)構(gòu)，被包繞的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞增多，并出現(xiàn)細(xì)胞的分化，開始形成成牙本質(zhì)細(xì)胞。小鼠牙胚發(fā)育早期，ED 14.5 d時(shí)，Notch蛋白在牙胚組織中特異性表達(dá)，但由于Notch通路上眾多分子參與，且與其他發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路多有交叉。本研究擬對(duì)牙胚發(fā)育早期，探尋與決定牙胚細(xì)胞命運(yùn)相關(guān)的Notch信號(hào)通路情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 牙胚組織的分離 C57BL/6小鼠妊娠第14.5天和第18.5天，將吸入麻醉后的孕鼠頸椎脫臼法處死,剖開子宮取出胎鼠,體視顯微鏡(Nikon SMZ1500，Japan)下，分離下頜第一磨牙牙胚組織，分離后投入凍存管，4%多聚甲醛固定24 h后-80 ℃冰箱保存，石蠟定向包埋，行冠狀截面10 μm冰凍組織切片。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 一組：ED 14.5 d C57BL/6小鼠下頜第一磨牙牙胚組織。二組：ED 18.5 d C57BL/6小鼠下頜第一磨牙牙胚組織。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 切片PBS(pH 7.2)洗5 min ×2次，10%馬血清37 ℃封閉30 min，PBS洗5 min ×3次，一抗孵育4 ℃過夜(濃度為1∶100)，PBS洗5 min×3次，二抗(生物素標(biāo)記驢抗兔多克隆IgG，濃度為1∶100)室溫孵育30 min。PBS洗5 min×3次， 三抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素,工作液)室溫孵育15 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯微鏡下顯色至滿意，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察、照相。

2 結(jié) 果

2.1 Notch蛋白在ED 14.5 d小鼠牙胚中表達(dá)

ED 14.5 d，牙齒發(fā)育帽狀期，小鼠下頜第一磨牙牙胚成釉器內(nèi)有Notch1的高表達(dá)，而成釉器周圍聚集的間充質(zhì)則未見明顯表達(dá)；Notch3在小鼠下頜第一磨牙牙胚成釉器及成釉器周圍聚集的間充質(zhì)細(xì)胞中均有較高的表達(dá)(圖1)。

2.2 ED 18.5 d牙胚形態(tài)

分離小鼠ED 18.5 d下頜第一磨牙牙胚，根據(jù)前期研究不同發(fā)育期小鼠下頜第一磨牙組織HE染色及免疫組織化學(xué)結(jié)果為基礎(chǔ)，在牙胚位置去除表面口腔上皮，取出牙胚組織，此時(shí)牙胚與周圍組織連接疏松，可以完整去除，牙冠已有牙尖形態(tài)成形(圖2)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，Notch1在小鼠下頜第一磨牙成釉器高表達(dá)，而成釉器周圍聚集的間充質(zhì)則未見明顯表達(dá)；Notch3在小鼠下頜第一磨牙牙胚成釉器和成釉器周圍聚集的間充質(zhì)細(xì)胞中均有高表達(dá)。Notch信號(hào)通路是一條高度保守的細(xì)胞間轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制系統(tǒng)，廣泛參與各種組織細(xì)胞的分化、增殖及凋亡過程，具有重要作用[5]。之前的研究發(fā)現(xiàn)Notch可能是維持小鼠頜下腺中干細(xì)胞數(shù)量的重要信號(hào)分子之一[6]，也證實(shí)了Notch信號(hào)通路在增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)分化中的潛在參與，并且在體外和體內(nèi)損傷后的牙髓細(xì)胞中均活化和動(dòng)態(tài)表達(dá)Notch信號(hào)[7]。Notch可能在維持牙髓干細(xì)胞的增殖和分化之間的正確平衡方面發(fā)揮重要作用，就像它們對(duì)造血干細(xì)胞那樣[8]。發(fā)育起始期及蕾狀期牙胚周圍是一個(gè)正在發(fā)育的牙囊[9]，對(duì)細(xì)胞譜系的研究表明，牙囊中的一些細(xì)胞也具有分化成牙乳頭細(xì)胞甚至牙髓細(xì)胞的能力,例如成牙本質(zhì)細(xì)胞[10]。處于某一發(fā)展階段的干細(xì)胞或前體細(xì)胞可能進(jìn)一步發(fā)育成其他細(xì)胞，也可能維持到成體時(shí)期[9]。牙髓干細(xì)胞存在自我更新和維持的控制機(jī)制，并且對(duì)使用牙髓干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療具有重要的潛在影響[11]。

A、B、C. Notch1在下頜第一磨牙成釉器高表達(dá)，放大倍數(shù)分別為100、200、400；D、E、F.Notch3在下頜第一磨牙成釉器及周圍聚集的間充質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，放大倍數(shù)分別為100、200、400；G、H.ED 14.5 d小鼠下頜第一磨牙成釉器已進(jìn)入帽狀期，其周圍有明顯的間充質(zhì)細(xì)胞聚集，今后將發(fā)育為牙乳頭，放大倍數(shù)分別為100、200。*.下頜發(fā)育中心；E′.成釉器；M′.間充質(zhì)

圖1ED14.5d小鼠下頜第一磨牙牙胚Notch1、Notch3免疫組化結(jié)果和下頜H&E染色結(jié)果

A.綠色虛線即為下頜第一磨牙牙胚處，星標(biāo)為舌；B.為去除舌的小鼠下頜組織；C.小鼠下頜左側(cè)第一磨牙牙胚取出后見綠框內(nèi)所示；D.為去除的下頜第一磨牙牙胚組織，可見牙尖外形(箭頭所示)

圖2ED18.5d小鼠下頜第一磨牙牙胚分離結(jié)果

Notch1從帽狀期的牙乳頭至牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)分泌期的牙髓中盡管表達(dá)較少，但它們中的一些是條索狀的，類似于神經(jīng)和血管細(xì)胞，也有一些是小圓形細(xì)胞，符合干細(xì)胞的形態(tài)特征。因此，Notch1也可能是牙髓干細(xì)胞的標(biāo)志物之一。Notch3不僅在發(fā)育的成釉器周細(xì)胞中表達(dá)，并且在具有發(fā)育潛力的間充質(zhì)細(xì)胞中也表達(dá)。Notch1、Notch3可能參與牙胚上皮細(xì)胞的分化，尤其是成釉上皮細(xì)胞的分化，可能在牙囊、牙乳頭和牙髓發(fā)育及發(fā)育成熟后維持干細(xì)胞中發(fā)揮作用。Notch信號(hào)在牙胚發(fā)生發(fā)育過程中有非常重要的調(diào)控作用，有必要進(jìn)一步探討激活Notch信號(hào)通路引導(dǎo)細(xì)胞增殖分化。