黃來全,劉大翔

(1.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院 血液內(nèi)科,安徽 蕪湖 241000； 2.池州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽 池州 247000)

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系8226細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用Gibco胎牛血清和1640培養(yǎng)基。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將8826細(xì)胞傳代，種于6 cm培養(yǎng)皿中，過夜，待細(xì)胞長到70%時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明將干擾片段或者20 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，靜置6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)BTK的8826細(xì)胞

1.5 PC 32765和LY333531溶劑的制備

1.6 骨髓中CD38+MM細(xì)胞的篩選

經(jīng)患者及其家屬同意，留取2015年至2017年在皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科診治的30例MM患者和骨科20例骨盆外傷患者的骨髓液，參見文獻(xiàn)[6]中的方法，分選多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓血腫瘤細(xì)胞；對照樣本為骨盆外傷患者外科術(shù)中留取的3 ml骨髓血，使用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞備用。

1.7 qR PCR檢測BTK、PKCβ和GAPDH mRNA水平

基因名稱引物序列BTK 正向引物5'-AGTACGACGTGGCCATCAAG-3' 反向引物5'-GCTATACATCAGGACTCCGGT-3'PKCβ 正向引物5'-AGCTTGTCTTAGAGGCCTTTCT-3' 反向引物5'-CCAGGAACATCAGCTTCTGACT-3'GAPDH 正向引物5'-TGGACCAAGTACATGAACCACC-3' 反向引物5'-CTGGTGATTGGACACGGTGA-3'

1.8 Western blotting檢測BTK、PKCβ、p65和GAPDH的蛋白表達(dá)水平

參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行跑膠、轉(zhuǎn)膜、敷抗體、洗膜、曝光。蛋白的表達(dá)情況以BTK、PKCβ、p65條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BTK與PKCβ在多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細(xì)胞中陽性率高于正常人骨髓血標(biāo)本

在30例MM患者的腫瘤細(xì)胞中，BTK表達(dá)陽性有9例，陽性率為30%，而在20例骨盆外傷患者的骨髓液樣本中，BTK表達(dá)陽性僅為1例，陽性率為5%；另一方面，PKCβ在MM患者腫瘤細(xì)胞中表達(dá)陽性有14例，陽性率為46.67%，而在骨盆外傷患者骨髓液樣本中表達(dá)陽性為3例，陽性率為15%(見圖1)。兩者差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 降低或者抑制BTK下調(diào)PKCβ的表達(dá)

2.3 降低或者抑制BTK使p65入核減少

2.4 過表達(dá)BTK使PKCβ表達(dá)上調(diào)和p65核內(nèi)分布增加

轉(zhuǎn)染了BTK過表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞BTK的表達(dá)量明顯上調(diào)，與此同時，PKCβ隨著BTK表達(dá)量的增加而增加，p65的入核也增加，見圖4。

2.5 PKCβ抑制劑LY333531可逆轉(zhuǎn)BTK過表達(dá)導(dǎo)致的N κB的過度激活

使用PKCβ抑制劑LY333531處理8226細(xì)胞，或者在過表達(dá)BTK的情況下再使用LY333531，結(jié)果顯示：PKCβ抑制劑LY333531可使PKCβ下降，p65入核減少，而對BTK無明顯影響；加了LY333531可使入核的p65減少。見圖5。

3 討 論

圖1BTK與PKCβ在多發(fā)性骨髓瘤患者腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況

Fig1ExpressionofBTKandPKCβintumorcellsofpatientswithmultiplemyeloma

與NC組比較，aP<0.05; bP<0.01

圖2BTK調(diào)控8226細(xì)胞PKCβ的表達(dá)

Fig2BTKregulatestheexpressionofPKCβ

圖3降低BTK抑制p65入核

Fig3ReducingBTKdecreasesp65nucleation

與NC組比較，aP<0.05

圖4過表達(dá)BTK上調(diào)PKCβ和促進(jìn)p65入核

Fig4OverexpressionofBTKincreasestheexpressionofPKCβandpromotesp65entryingnucle