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        IBDV細胞適應株的馴化及其VP2基因的分子特征分析

        2018-08-10 07:22:04王潔瓊趙玉杰周薇帆周云飛陳田田劉建勛李新生

        王潔瓊,趙玉杰,周薇帆,周云飛,陳田田,劉建勛,李新生

        (河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

        傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是一種可以誘發(fā)雛雞產生急性、高度接觸性和免疫抑制的傳染病,該病首先在美國特拉華州甘布羅鎮(zhèn)出現(xiàn),故又被稱為“甘布羅病”。由于死于該病的雞腎臟受損,最初被稱為“禽腎病”,但后來被正式命名為雞傳染性法氏囊病(IBD)[1-2]。

        傳染性法氏囊病毒(IBDV)屬雙股RNA病毒科禽雙股RNA病毒屬,病毒顆粒為單層衣殼結構,無囊膜,是典型的六邊形結構,呈正二十面體。IBDV有2個血清型,其中對雞有致病性的血清Ⅰ型毒株又分為經(jīng)典毒株(classical IBDV,cIBDV)、減毒株(attenuated IBDV)、變異毒株(variation IBDV,vIBDV)和超強毒株(very virulent IBDV,vvIBDV)[3]。IBDV超強毒株的出現(xiàn),嚴重威脅著世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展,被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為“影響社會經(jīng)濟的重要疾病”[4]。有研究表明,IBDV的VP2蛋白是主要的宿主保護性抗原,與病毒中和抗體的誘導、抗原和毒力的變異以及細胞的凋亡密切相關[5-6]。VP2蛋白的氨基酸變異對病毒侵染宿主靶細胞的過程至關重要,是影響IBDV細胞嗜性和毒力差異的主要因素。因此,對不同毒株的VP2進行氨基酸序列分析,不僅有助于了解毒株之間的親緣關系,分析IBD的流行特點,還能為其病原抗原性和毒力的研究積累資料。本研究對從河南某地區(qū)雞群分離出的1株IBDV進行馴化,使其適應永生細胞DF-1,并對其VP2基因進行克隆和生物信息學分析,從氨基酸序列及系統(tǒng)進化樹方面分析探討了毒株間基因變異的分子機制,旨在為篩選到免疫原性良好的IBD疫苗株奠定基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材 料

        1.1.1 毒株、SPF雞胚和細胞 IBDV毒株X1分離自河南某地區(qū)雞群的發(fā)病雞中。SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗技術有限公司。DF-1細胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。雞胚成纖維細胞(CEF細胞)應用10日齡SPF雞胚制備。

        1.1.2 主要試劑 LATaq酶、DNA Marker 5000、MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit Ver 5.0、M-MLV反轉錄酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶,均購自寶生物工程(大連)有限公司;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,購自天根生化科技(北京)有限公司;大腸桿菌(E.coli) BL21(DE3),由本實驗室保存;高純度質粒小提試劑盒,購自康為世紀生物科技有限公司;pGEM-T Easy Vector,購自Promega公司。

        1.1.3 引物設計合成 參照GenBank上已登錄的IBDV UK661株A片段mRNA序列(X92760),利用Oligo 7.0軟件分析并設計1對引物,擴增產物長度為1 756 bp的包含VP2全長基因的片段。引物序列為:上游引物P17.5′-GAACTCCTCCTTCTACAATGCT-3′;下游引物P56.5′-TCGTGATGACCACAGGGAATAG-3′。引物由華大基因合成。

        1.2 IBDV X1株雞胚半數(shù)致死量(ELD50)的測定

        IBDV X1毒株在SPF雞胚上穩(wěn)定傳代后,將雞胚絨毛尿囊膜研磨液上清液進行10倍梯度稀釋,選取10-5,10-6,10-7,10-8,10-95個稀釋度,經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚,每個稀釋度病毒接種5枚雞胚,接種量均為0.1 mL/枚,于37 ℃孵化器內孵化,剔除24 h內死亡雞胚,至144 h時記錄各組雞胚死亡情況及胚體病變情況,按文獻[7]中介紹的Reed-Muench法計算尿囊膜懸液中病毒的ELD50。

        1.3 IBDV X1株的DF-1細胞適應性馴化

        法氏囊組織的處理參照文獻[8]進行,取按照上述方法得到的上清液,參照文獻[9]將IBDV X1株經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10日齡SPF雞胚,收集48~120 h內死亡雞胚,研磨后如上繼續(xù)傳代。取傳至第8代的IBDV雞胚毒用PBS按照1∶200體積比稀釋,接種按常規(guī)方法制備長成單層的CEF細胞,于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱吸附1 h后棄去病毒液,加入維持液,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天觀察,待80%細胞出現(xiàn)病變(培養(yǎng)72~96 h)時傳代,共傳10代。取傳至第10代的IBDV CEF細胞毒接種DF-1細胞,依上述方法連續(xù)傳代,每天觀察細胞病變。

        1.4 IBDV X1株細胞適應株的電鏡觀察

        將細胞毒凍融3次,4 000 r/min離心20 min,取上清液10 000 r/min離心1 h,棄去沉淀,取上清液38 000 r/min超速離心1 h,棄上清液,將沉淀用少量pH 7.4的0.01 mol/L PBS懸浮,制備負染樣品。用懸浮法吸附10 min后用質量分數(shù)2%磷鎢酸染色5 min,使用Hitachi HT 7700透射電子顯微鏡進行觀察。將獲得的細胞適應株命名為C1。

        1.5 IBDV RNA的提取及cDNA的合成

        將X1毒株的病毒上清液經(jīng)0.22 μm濾器過濾除菌后,以CAM途徑接種10日齡SPF雞胚,每胚0.2 mL,棄去24 h內死亡雞胚,收獲48~120 h內死亡雞胚,觀察雞胚死亡狀況,并無菌收取絨毛尿囊膜,研磨至勻漿,反復凍融3次后5 000 r/min離心10 min,取上清液。按MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit Ver 5.0說明書提取RNA。

        將收獲的C1株DF-1細胞毒的病毒液反復凍融3次,3 500 r/min離心20 min,取上清液。按MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction kit Ver 5.0說明書提取RNA。

        用下游引物P56(濃度為25 μmol/L)將上述2種RNA反轉錄合成cDNA。具體操作為:取10 μL RNA提取物,加入1 μL下游引物P56,70 ℃水浴10 min,冰浴5 min,加入dNTP 1 μL 、反轉錄酶M-MLV 0.5 μL、5×M-MLV Buffer 4 μL、RNasin 0.5 μL、ddH2O 3 μL,42 ℃反應1 h,最后75 ℃ 15 min使反轉錄酶失活。

        1.6 VP2基因的克隆

        以cDNA為模板對VP2基因進行PCR擴增。擴增體系為:cDNA 2 μL,LATaq酶12.5 μL,P17(25 μmol/L) 0.5 μL,P56(25 μmol/L) 0.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序為:95 ℃預變性5 min;94 ℃變性50 s,53 ℃退火50 s,72 ℃延伸2 min,總計34個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

        將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離,目的片段用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收,操作按說明書進行。將回收產物與pGEM-T Easy載體16 ℃過夜連接后,按常規(guī)方法轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。進行藍白斑篩選,挑取生長狀態(tài)良好的菌落接種于含50 mg/L氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng),以4 μL培養(yǎng)菌液為模板,進行PCR鑒定(反應體系和反應程序同1.6節(jié))。將鑒定陽性的菌液用高純度質粒小提試劑盒提取其質粒,送至武漢奧科鼎盛生物科技有限公司測序。

        1.7 序列分析

        用DNA Star和MEGA 6.0軟件將測序所得結果與GenBank上登錄的17個IBDV序列(表1)進行同源性分析,并構建遺傳系統(tǒng)進化樹。同時應用Clustalx軟件對它們的VP2基因高變區(qū)推導的氨基酸序列與這17個IBDV參考毒株進行比對分析。

        表1 IBDV參考毒株及其GenBank登錄號Table 1 IBDV reference strain and its GenBank accession number

        表1(續(xù)) Continued table 1

        應用DNA STAR軟件對X1株及其細胞適應株C1的VP2高變區(qū)及七肽區(qū)推導的氨基酸進行比對分析。

        2 結果與分析

        2.1 IBDV X1株的ELD50

        稀釋10-5,10-6,10-7,10-8,10-9的雞胚絨毛尿囊膜研磨液的雞胚死亡率分別為100%,100%,50%,37.5%和10%,利用Reed-Muench法計算出雞胚分離物中病毒的ELD50為10-8mL-1。

        2.2 IBDV X1株細胞適應株的馴化

        將IBDV X1株雞胚病毒液接種長成單層的CEF細胞傳代并觀察細胞病變,傳至第10代時細胞病變穩(wěn)定,第10代72 h時CEF細胞圓縮、脫落懸浮(圖1)。將第10代的IBDV CEF細胞毒接種DF-1細胞傳代,至第8代細胞產生穩(wěn)定病變,第8代72 h時細胞圓縮,折光度增強,逐漸脫落懸浮,有拉網(wǎng)現(xiàn)象(圖2)。結果表明,分離株(X1株)細胞適應株馴化成功,命名為C1株。

        A.單層CEF細胞;B.第10代IBDV感染72 h的CEF細胞A. Single layer of CEF cells; B. The 10th generation of IBDV infected with CEF cells for 72 h圖1 IBDV X1株對CEF細胞的適應性馴化Fig.1 Adaptability of IBDV strain X1 to CEF cells

        A.單層DF-1細胞;B.接種第8代IBDV X1株CEF細胞毒72 h后的DF-1細胞A.Single layer of DF-1 cells;B.The status of DF-1 cells after 72 hours of inoculation with the 8th generation IBDV strain X1 from CEF cells圖2 IBDV X1株CEF細胞毒對DF-1細胞的適應性馴化Fig.2 Adaptability of IBDV X1 strain CEF cytotoxicity to DF-1 cells

        2.3 IBDV C1株細胞毒負染樣品透射電子顯微鏡觀察結果

        經(jīng)提純濃縮的病毒液懸滴負染后在透射電子顯微鏡下觀察,可見單個病毒粒子呈六邊形或卵圓形,無囊膜,病毒直徑50~60 nm,有實心和空心2種病毒(圖3)。

        圖3 IBDV C1株病毒粒子的透射電子顯微鏡觀察(×50 000)Fig.3 Observation of IBDV strain C1 of virus particles using electron microscopic negative staining method (×50 000)

        2.4 IBDV VP2基因的克隆及鑒定

        基因克隆結果顯示,X1和C1株病毒均能擴增出長度約為1 756 bp的條帶,表明2株病毒均為IBDV毒株(圖4)。菌液PCR產物鑒定結果顯示,隨機挑取的菌落中均可以擴增出與RT-PCR反應長度相同的條帶(圖5)。

        2.5 IBDV VP2基因序列測定及分析

        表2結果顯示,分離株X1與超強毒株GX、OKYM、HK46、UK661、D6948的同源性較高,均為99.3%;C1株與減毒株CEF94(8號毒株)同源性較高,為99.6%,與X1株同源性為96.7%。通過對IBDV分離株及細胞適應毒株VP2基因推導的氨基酸序列同源性進行比較分析判斷,分離株X1為超強毒株,X1株的細胞適應毒株C1與減毒株同源性較高,毒力致弱,具有選為疫苗株的潛力。

        對分離株X1及其細胞適應毒株C1的VP2基因推導的氨基酸序列與表1中引用的IBDV參考毒株氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹,結果(圖6)表明,X1株與中國香港超強毒株HK46親緣關系較近,細胞適應毒株C1與減毒株CEF94親緣關系較近。

        M.DNA Marker DL5000;1.X1株;2.C1株 M.DNA Marker DL5000;1.Strain X1;2.Strain C1 M.DNA Marker DL5000;1.X1株;2.C1株 M.DNA Marker DL5000;1.Strain X1;2.Strain C1圖4 IBDV毒株VP2基因的RT-PCR擴增結果 圖5 IBDV毒株VP2基因的菌液PCR擴增結果Fig.4 RT-PCR of the VP2 gene of IBDV strains Fig.5 Bacteria liquid PCR of the VP2 gene of IBDV strains

        毒株StrainsX1C11234567891011121314151617X196.799.399.399.399.399.397.196.797.196.098.297.195.698.296.296.796.286.3C13.497.197.197.197.197.199.698.799.698.298.297.696.598.297.497.897.486.910.72.9100.0100.0100.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.720.72.90.0100.0100.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.730.72.90.00.0100.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.740.72.90.00.00.0100.097.697.497.696.798.997.896.298.996.997.496.986.750.72.90.00.00.00.097.697.497.696.798.997.896.298996.997.496.986.7

        表2(續(xù)) Continued table 2

        注:右上三角表示同源性(%),左下三角表示分歧度;1~17對應的毒株同表1。

        Note:Identity in upper triangle (%) while divergence in lower triangle.The strain numbers of 1-17 are the same as Table 1.

        2.6 IBDV C1株和X1株的VP2高變區(qū)及七肽區(qū)推導氨基酸比對

        在對IBDV分離株X1進行傳代使其適應細胞的過程中,VP2高變區(qū)及七肽區(qū)部分氨基酸發(fā)生了變異(表3)。

        表3 IBDV C1和X1株的VP2高變區(qū)(206~305位氨基酸)及七肽區(qū)(326~332位氨基酸)氨基酸突變情況Table 3 Changes in amino acid of VP2 hypervariable region (amino acids 206 to 305) and septapeptides (amino acids 326 to 332) of IBDV strain C1 and strain X1

        注:P.脯氨酸;V.纈氨酸;K.賴氨酸;H.組氨酸;N.天冬酰胺;T.蘇氨酸;L.亮氨酸;E.谷氨酸;R.精氨酸;A.丙氨酸;I.異亮氨酸;Q.谷氨酰胺;D.天冬氨酸;S.絲氨酸。

        Note:P.Proline;V.Valine;K.Lysine;H.Histidine;N.Asparagine;T.Threonine;L.Leucine;E.Glutamic acid;R.Arginine;A.Alanine;I.Isoleucine;Q.Glutamine;D.Aspartic acid;S.Serine.

        表3結果顯示,C1株與X1株VP2相比,在第206~305位VP2高變區(qū)有11個位點發(fā)生了改變,七肽區(qū)有1個位點發(fā)生了改變。改變如下:222位(A→P)、242位(I→V)、249位(Q→K)、253位(Q→H)、256位(I→V)、279位(D→N)、284位(A→T)、290位(T→L)、294位(I→L)、299位(S→N)、300位(K→E)以及七肽區(qū)的330位(S→R)。vvIBDV X1株在第222,256,294位和299位上具有A、I、I、S 4個特征性氨基酸,這與何秀苗等[10]的研究相同。2012年,侯仲杰等[11]在研究IBDV基因組A節(jié)段編碼前體多聚蛋白的遺傳蹤跡時也發(fā)現(xiàn),超強毒株與減毒株的242,253,299及330位氨基酸均不同。超強毒株X1的DF-1細胞適應毒株C1也出現(xiàn)了相應的變化。通常被認為與毒力變異相關的七肽區(qū)含有6個保守氨基酸殘基,若其中1個或2個絲氨酸被取代則必將導致毒力下降[12],而減毒株C1在第330位的精氨酸R取代了超強毒株X1在330位的絲氨酸S。

        3 討 論

        雞IBD主要攻擊法氏囊并感染囊泡中的B前淋巴細胞,導致淋巴細胞溶解減少,最終致使囊萎縮,其不僅直接導致感染雞的發(fā)病與死亡,還可引起免疫抑制使雞對次生細菌或病毒的感染高度敏感,對疫苗接種的免疫應答能力下降[13]。1986年以后,由于IBDV超強毒株的出現(xiàn),使IBD的流行出現(xiàn)了一些新的特點,流行的地域性、抗原性、發(fā)病率、死亡率、病理變化與經(jīng)典IBD均有差異,使得IBD的防治面臨新的挑戰(zhàn)與困難。本研究成功克隆了從河南某雞場分離到的IBDV X1毒株的VP2全長基因,對其與NCBI上登錄的其他IBDV毒株的VP2基因的氨基酸序列進行比較分析,對其致病性、VP2基因進行了系統(tǒng)的分析和鑒定。結果顯示,X1毒株對10日齡SPF雞胚的ELD50為10-8mL-1,其在第222,256,294和299位上具有A、I、I、S 4個特征性氨基酸,與vvIBDV HK46VP2基因的氨基酸序列同源性高達99.3%,確定分離株X1為vvIBDV。

        雞IBDV經(jīng)典毒株、變異毒株和超強毒株等自然野毒株均不適應CEF等細胞的培養(yǎng),必須在細胞或雞胚上盲傳數(shù)代,使其對雞的毒力減弱成為減毒株,病毒才可以在細胞上增殖。對于毒力不返強的減毒株可篩選為IBDV活疫苗株。本研究完成了一株vvIBDV毒株致弱的全過程,將分離的1株IBDV超強毒株X1經(jīng)雞胚傳代8代次,CEF細胞傳代10代次,DF-1細胞傳代8代次毒力獲得細胞適應毒株C1,并對其進行VP2全基因克隆分析。結果顯示,在七肽區(qū)減毒株C1在第330位精氨酸R取代了超強毒株X1在330位的絲氨酸S;第222位氨基酸均由A變成P;決定病毒毒力的位點第256和284位分別由I、A變?yōu)閂和T。在IBDV VP2可變區(qū)的270~290位氨基酸之間是其3個小的親水區(qū)之一,有研究推測279和284位氨基酸的變化導致這一區(qū)域的親水性下降并阻止α-螺旋的形成,從而影響到病毒的表面結構,這一結果暗示了VP2可變區(qū)的279和284位氨基酸殘基對IBDV的毒力變化起著比較關鍵的作用。細胞適應毒株C1在279位由天冬酰胺N替代了超強毒株X1的天冬氨酸D,在284位由蘇氨酸T替代了丙氨酸A。細胞適應毒株能夠在DF-1上穩(wěn)定增殖,而且容易大量培養(yǎng),病毒滴度較高,預測其具備作為滅活疫苗種毒或弱毒疫苗種毒的特征,對于此毒株的免疫原性,本實驗室將會進一步進行深入的研究。

        目前,IBD的控制很大程度上依賴于疫苗的應用,一個理想化的疫苗應保護雞群抵抗疾病,尤其是在發(fā)病的急性期[14]。但減毒活疫苗和滅活疫苗都有其不同的局限性。在減毒活疫苗的情況下,選擇壓力導致變異毒株的產生,導致保護失敗和疾病的持續(xù)爆發(fā)[15]。同時活疫苗與母源抗體也會沖突,而滅活疫苗也存在缺點如成本和生產復雜性[16]。DNA疫苗接種是預防和控制疾病的替代方法。DNA疫苗接種包括注射攜帶編碼抗原的基因的質粒DNA,疫苗不包含完整病毒,可防止與常規(guī)疫苗相關的問題,如復發(fā)的毒力、變異毒株的出現(xiàn)等。但DNA疫苗在目前的研究中對其是否具有交叉保護尚不清晰[17]。VP2蛋白是IBDV主要的宿主免疫保護性結構蛋白,并且是引起病毒抗原變異的決定因素[18]。因此在以后的試驗中,將對IBDV VP2蛋白做進一步研究與探索。

        本研究對1株vvIBDV X1及其細胞適應株C1與參考毒株的同源性進行了比對以及進化樹和VP2氨基酸序列分析,比較總結其差異,初步揭示了vvIBDV在適應細胞、從超強毒力向弱毒力轉化過程中,VP2高變區(qū)及七肽區(qū)氨基酸序列的變化情況,為培育篩選到免疫原性好的IBD疫苗株奠定了基礎。

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