單志強(qiáng) 許西 郭文婕

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一種來源于發(fā)育早期中胚層干細(xì)胞，具有干細(xì)胞的特性，來源廣泛，是開展干細(xì)胞移植、工程技術(shù)的理想種子細(xì)胞[1-2]。人MSCs成脂分化技術(shù)有成為人體軟組織修復(fù)技術(shù)，但MSCs的分化受到多種因素的影響，有關(guān)于調(diào)控機(jī)制的研究較少[3]。本文嘗試就此進(jìn)行探。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從健康骨髓捐獻(xiàn)骨髓中獲得5～10 ml樣本，采用傳統(tǒng)的人淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法獲得骨髓單個(gè)核細(xì)胞。

1.2 儀器與試劑

試劑：DNA提取試劑盒，PCR鑒定引物，DMEM/F-12完全培養(yǎng)液，平衡鹽溶液PBS，胎牛血清、MTT試劑盒、雙抗等。儀器主要包括酶標(biāo)儀、水浴鍋、低溫高速離心機(jī)、倒置顯微鏡照相系統(tǒng)、PCR儀、超凈工作臺(tái)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、普通離心機(jī)、超低溫冰箱等。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)、鑒定 將獲得的骨髓單個(gè)和西北，采用原代培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，導(dǎo)致顯微鏡評(píng)估原代BM-MSCc貼壁生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示貼壁良好，呈放射狀克隆性生長(zhǎng)。而獲進(jìn)行穿戴培養(yǎng)、擴(kuò)增，獲得第一代細(xì)胞計(jì)為P1，而后繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%融合，繼續(xù)采用消化離心穿戴培養(yǎng)法培養(yǎng)，依次將第2-n代細(xì)胞記作P2、P3、P4……，Pn代細(xì)胞。將獲得的各代細(xì)胞，1 200 rpm/5 min，室溫下離心，棄上清，采用DMSO凍存液重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整濃度為2.4×106/ml，每個(gè)凍存管1.5 ml懸液分裝，4 ℃冰箱保存30 min，而后-20 ℃凍存1 h，轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱放置過夜，次日液氮罐保存，在1個(gè)月內(nèi)使用。使用前，進(jìn)行復(fù)蘇，以供使用。使用前，進(jìn)行BM-MScs表面分子標(biāo)志檢測(cè)，采用藻紅蛋白（PE）標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、CD34、CD31，異硫氰酸熒光素標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體GAPD標(biāo)記，同時(shí)分別采用相應(yīng)PE-小鼠抗人IgG1、FITC-小鼠抗人IgG1作為同型對(duì)照抗體。

1.3.2 成脂分化能力與基因表達(dá)鑒定 （1）誘導(dǎo)BM-MSCs向脂肪細(xì)胞分化：①消化、離心收集P4-P6代BM-MSCs，采用4×104孔接種細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，代細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液；②每孔加入2 ml成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3日，換液1次，持續(xù)14日；③完畢后棄培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗洛細(xì)胞2次，4%甲醛固定30 min，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次；④每孔加入0.2%油紅O染色1～2 m，37℃染色孵育30 min，吸去染液，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次；⑤導(dǎo)致顯微鏡檢查。

（2）成脂細(xì)胞特異性基因RT-PCR檢測(cè)：對(duì)照組、成脂分化實(shí)驗(yàn)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)后獲得細(xì)胞層，加入500 μl蛋白質(zhì)裂解液，冰上裂解，期間晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，保證裂解液覆蓋在每一個(gè)角落，裂解完后，細(xì)胞刮刀刮下破碎的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管，13 200 rpm，4 ℃離心20 min，轉(zhuǎn)入上清到EP管，沸水浴5 min使蛋白變性，冷卻后離心，轉(zhuǎn)移到新的EP管，分出100 μl定量，其余-70℃保存，收集蛋白質(zhì)。采用Real-Time PCR驗(yàn)證質(zhì)譜分析，以差異蛋白組學(xué)分析得到的脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、過氧化物酶體增殖劑激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為檢測(cè)對(duì)象，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)這些蛋白質(zhì)的基因R-t PCR反應(yīng)引物。

2 結(jié)果

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)、傳代情況

分離培養(yǎng)得到的間充質(zhì)干細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察顯示如下，接種后可間少量形態(tài)各異的細(xì)胞貼于培養(yǎng)瓶底部，梭型、多角形不規(guī)則散在分布，培養(yǎng)5～7日后，貼壁成克隆性生長(zhǎng)，14～21日細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)逐漸均一，成長(zhǎng)梭型。見圖1 A～D。

圖1 間充質(zhì)細(xì)胞-原代細(xì)胞培養(yǎng)各個(gè)時(shí)間表現(xiàn)情況

2.2 表面標(biāo)記免疫熒光檢測(cè)

表面標(biāo)記免疫熒光檢測(cè)結(jié)果如下，P3、P9、P16代的間充質(zhì)干細(xì)胞CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH表達(dá)不存在顯著差異，在進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，維持比較穩(wěn)定的免疫表型標(biāo)志物表達(dá)譜。從上到下分別為CD90、CD73、CD71、CD44、CD29、GAPDH免疫表現(xiàn)，從左邊到有分別為第P3、P9、P16代細(xì)胞，見圖2。

2.3 向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的油紅O染色鏡下表現(xiàn)

誘導(dǎo)前5天，細(xì)胞形態(tài)沒有明顯變化。誘導(dǎo)第7天，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，形態(tài)學(xué)觀察顯示，誘導(dǎo)后的細(xì)胞體積增大，少部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)小脂滴。誘導(dǎo)10天后，含脂滴的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，隨著細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)行，小的脂滴匯合形成大的脂滴。在高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)14天后含有脂滴的細(xì)胞數(shù)量比例明顯增多。未加成脂誘導(dǎo)劑的對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)始終沒有明顯變化，細(xì)胞內(nèi)也沒有脂滴出現(xiàn)。分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組誘導(dǎo)后第5天、10天、14天的細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色，可見實(shí)驗(yàn)組第7天開始細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴并被染成紅色，而且脂滴數(shù)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加而增加并由小的脂滴逐漸聚集成大的脂滴。而對(duì)照組細(xì)胞油紅O染色均呈陰性。

圖2 表面標(biāo)記免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

2.4 脂肪細(xì)胞特異性基因檢測(cè)

脂肪細(xì)胞特異性基因RT-PCT檢測(cè)結(jié)果如下，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組第7天、10天、14天的LPL、PPAR-γ基因表達(dá)高于對(duì)照組（無表達(dá)），同時(shí)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)信號(hào)強(qiáng)度明顯逐漸上升，提示間充質(zhì)干細(xì)胞成脂化與LPL、PPAR-γ基因表達(dá)有關(guān)，見圖3。

圖3 脂肪細(xì)胞特異性基因RT-PCR檢測(cè)

3 討論

LDL即脂蛋白脂肪酶基因，其中內(nèi)含子6中PVU Ⅱ多態(tài)位點(diǎn)和內(nèi)含子8中HindⅢ多態(tài)位點(diǎn)與高脂血癥有關(guān)，并為高脂血癥的家系連鎖分析提供了遺傳標(biāo)記，增加CM殘粒結(jié)合到LPL受體的能力[4-5]。本次研究顯示，人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，特別是在第7日達(dá)到脂分化高峰，在第10日仍然呈現(xiàn)持續(xù)脂分化。提示PPARs控制許多細(xì)胞內(nèi)的代謝過程，是重要的細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物脂肪組織中呈現(xiàn)高表達(dá)[6-7]。在敲除PPAR-γ基因試驗(yàn)中，小鼠往往會(huì)在胚胎期死亡，體現(xiàn)PPAR-γ基因的重要性[8]。PPAR-γ基因與脂代謝過程中的多種基因如脂肪酸吸收（LPL）、脂類運(yùn)輸（Fabp4）等關(guān)系密切，通過調(diào)節(jié)脂肪因子表達(dá)，從而參與成脂化[9]。

需要注意的是，本文中采用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)成脂化，而充間質(zhì)干細(xì)胞的分化影響因素較多，其他成脂分化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究[10]。除以上特異性基因外，還存在其他許多脂肪因子基因，有鑒于成脂化的復(fù)雜機(jī)制，需要開展更多的基因分析，以構(gòu)建基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，為成脂化調(diào)控提供理論基礎(chǔ)[11-12]。由此可見，人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。

綜上所述，人間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化可能與LPL、PPAR-γ基因表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。