劉 鳴 王大英 張文全 徐佑龍 金惠根 劉宗軍

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科 上海 200062)

急性心肌梗死是臨床常見(jiàn)的危重癥,對(duì)急性閉塞血管行再灌注治療是挽救缺血心肌及改善臨床預(yù)后最有效的方法,但同時(shí)也會(huì)造成心肌的缺血再灌注損傷(ischemic-reperfusion injury,IRI),嚴(yán)重影響療效。不論是血流中斷、缺氧引起的心肌細(xì)胞壞死,還是再灌注后的氧化應(yīng)激等機(jī)制引起的心肌損傷,或是本身即富含炎癥免疫成分的血流灌注,以上早期即可引發(fā)局部及全身的非特異性炎癥免疫反應(yīng),貫穿并直接影響心肌損傷及修復(fù)的全過(guò)程[1-3]。單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)等炎癥細(xì)胞是IRI相關(guān)炎癥免疫反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),是識(shí)別損傷、調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的主體[4]。早在1993年Zhang等[5]在大鼠心肌梗死模型的免疫組化研究中發(fā)現(xiàn)缺血梗死的心肌邊緣有大量DC浸潤(rùn),臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死急性期患者外周血DC急劇減少[6-7],與早期預(yù)后有關(guān);但DC在梗死心肌的定量分析、在總體炎癥細(xì)胞中所占比例以及與時(shí)間相關(guān)的變化規(guī)律,仍缺乏相關(guān)研究。針對(duì)這一問(wèn)題,我們采用小鼠心臟單個(gè)細(xì)胞懸液制備方法,在小鼠心臟IRI模型中對(duì)心肌DC進(jìn)行定量分析,選擇CD11c作為流式細(xì)胞檢測(cè)的特異性標(biāo)記,同時(shí)研究單核細(xì)胞的Ly6C標(biāo)記,以期為IRI的相關(guān)免疫炎癥反應(yīng)這一龐大炎癥機(jī)制網(wǎng)絡(luò)提供重要補(bǔ)充。

材 料 和 方 法

材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:10～12周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(批準(zhǔn)號(hào):SCXK滬2012-0002)。主要試劑及儀器:RPMI-1640培養(yǎng)基、膠原酶Ⅰ購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,DNase Ⅰ購(gòu)自美國(guó)MBI公司,流式細(xì)胞抗體PE-Cy5 anti-mouse CD45、PE anti-mouse CD11c及同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司,FITC Rat Anti-Mouse Ly6C及同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)BD公司;流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

動(dòng)物模型制備小鼠經(jīng)乙醚麻醉后行氣管插管,連接呼吸機(jī),設(shè)定呼吸機(jī)潮氣量200～300μL,頻率120次/min,連接心電圖。取左前胸部切開(kāi),逐層分離皮下組織,在第3肋間用胸廓撐開(kāi)器暴露手術(shù)視野,打開(kāi)心包,暴露心臟,以左心耳及肺動(dòng)脈圓錐為標(biāo)志尋找前降支,以8-0絲線在左心耳下1～2 mm處進(jìn)針。假手術(shù)組僅穿線不結(jié)扎,IRI手術(shù)組穿線后繞兩圈打一個(gè)活結(jié),肉眼觀察結(jié)扎線至心尖部位的心肌變蒼白,活動(dòng)減弱,心電圖出現(xiàn)特征性ST段抬高并與增寬的QRS波群融合,說(shuō)明結(jié)扎成功。留取較長(zhǎng)的活結(jié)線頭至胸外以備松解?？p合胸壁后繼續(xù)呼吸機(jī)輔助呼吸及乙醚麻醉,結(jié)扎30 min后拉胸外的活結(jié)線頭進(jìn)行松解,心電圖ST段逐漸回落,證明心臟IRI模型制備成功(圖1)。分別在再灌注1、2、4和7天時(shí)摘取小鼠心臟制備心臟單個(gè)細(xì)胞懸液。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3～7只小鼠。

心肌單個(gè)細(xì)胞懸液制備配置心臟消化液:在RPMI-1640培養(yǎng)基溶液,加入1.6 mg/mL膠原酶Ⅰ和0.2 mg/mL DNase,每個(gè)心臟標(biāo)本用量約11 mL。小鼠心臟摘取后PBS沖洗去除血液,于2 mL離心管中加入1 mL心臟消化液,盡量剪碎;移至15 mL離心管中,加入10 mL心臟消化液,室溫放置60 min,間斷混勻。140目濾網(wǎng)過(guò)濾,收集濾過(guò)液于15 mL離心管中,114×g離心10 min,去上清,加入200μL PBS懸浮+2 mL紅細(xì)胞裂解液放置5 min,114×g離心5 min,去上清后用1 mL PBS懸浮。對(duì)心肌單個(gè)細(xì)胞懸液行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

圖1 正常、缺血及再灌注小鼠心電圖

流式細(xì)胞檢測(cè)與分析策略以CD45標(biāo)記白細(xì)胞(圖2A),選取CD45陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)一步以CD11c和Ly6C標(biāo)記細(xì)胞亞群(圖2B,縱軸CD11c,橫軸Ly6C)。取200μL懸浮液同時(shí)加入CD45、CD11c、Ly6C抗體或同型對(duì)照,10 min后PBS洗1次,避光待流式細(xì)胞檢測(cè),同型對(duì)照管只在最初測(cè)試抗體特異性時(shí)設(shè)置。獲取200 000～700 000個(gè)細(xì)胞(根據(jù)其中CD45陽(yáng)性細(xì)胞比例調(diào)整)。

A:Leukocyte;B:DCs and monocyte subpopulation.

圖2假手術(shù)組及心臟IRI組術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠心臟單個(gè)細(xì)胞懸液的流式細(xì)胞檢測(cè)圖
Fig2Flowcytometryforsinglecellsuspensionsfrommice’sheartinthesham-operatedgroupandcardiacIRIgroupatdifferenttimepoints

結(jié) 果

細(xì)胞計(jì)數(shù)每個(gè)心臟標(biāo)本制備所得的單個(gè)細(xì)胞懸液獲得的細(xì)胞總數(shù)為(1～2)×106個(gè)。

各組細(xì)胞的比例變化CD45陽(yáng)性細(xì)胞占心肌細(xì)胞的比例、CD45陽(yáng)性細(xì)胞中CD11c和Ly6C標(biāo)記的4組細(xì)胞的相對(duì)比例如表1所示。對(duì)假手術(shù)組、不同缺血再灌注時(shí)間的IRI組進(jìn)行組間比較,結(jié)果顯示以下指標(biāo)在組間具有顯著差異:CD45細(xì)胞比例、CD11c+Ly6C-、CD11c+Ly6C+、CD11c-Ly6C+細(xì)胞相對(duì)比例(表1);CD11c-Ly6C-細(xì)胞相對(duì)比例在組間未見(jiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。變化規(guī)律如下:(1)CD45陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例在再灌注1天時(shí)即達(dá)到高峰,之后逐漸恢復(fù)至對(duì)照組水平(其中1天時(shí)為13.88%,較對(duì)照組的0.90%,P<0.05;2、4和7天時(shí)與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)CD45陽(yáng)性細(xì)胞群中CD11c和Ly6C標(biāo)記的細(xì)胞亞群的相對(duì)比例不同。對(duì)照組CD11c+Ly6C+細(xì)胞相對(duì)比例最低為6.87%、CD11c-Ly6C+最高為56.72%。小鼠心臟IRI模型中CD11c+Ly6C+DC動(dòng)態(tài)變化最為明顯,持續(xù)升高(1、2和4天與對(duì)照組相比,P均<0.05),7天時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05);與之相反,CD11c-Ly6C+單核細(xì)胞比例在再灌注后降低(2和4天分別與對(duì)照組相比,P均<0.05),7天時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05);CD11c+Ly6C-DC相對(duì)比例的變化呈降低后再升高的趨勢(shì)(2和4天分別較1天升高,P均<0.05),7天時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(P>0.05);CD11c-Ly6C-細(xì)胞無(wú)顯著變化(組間比較P>0.05)。再灌注2天時(shí)CD11c+Ly6C-、CD11c+Ly6C+、CD11c-Ly6C+約各占CD45陽(yáng)性細(xì)胞的1/3。

LeukocyteShamIRI 1 dIRI 2 dIRI 4 dIRI 7 dχ2PCD45+0.90±0.2513.88±10.70(1)10.68±3.863.44±1.610.87±0.5117.620.001Q1 (CD11c+Ly6C-)25.58±15.7011.73±1.8429.06±5.3640.73±9.0921.00±5.5812.590.013Q2 (CD11c+Ly6C+)6.87±3.3230.53±3.70(1)32.74±4.09(1)19.80±1.21(1)6.46±1.3018.250.001Q3 (CD11c-Ly6C+)56.72±19.9050.03±5.0830.36±5.00(1)30.80±9.77(1)57.83±5.8614.300.006Q4 (CD11c-Ly6C-)10.81±4.237.72±2.157.84±1.768.68±0.8814.70±3.247.550.109

(1)vs.Sham,P<0.05.

各組細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比變化CD11c、Ly6C標(biāo)記的4組細(xì)胞在總心肌細(xì)胞中的百分比,即各組在CD45陽(yáng)性細(xì)胞中的相對(duì)比例×CD45陽(yáng)性細(xì)胞在總心肌細(xì)胞比例。對(duì)假手術(shù)組和不同時(shí)間點(diǎn)的IRI組進(jìn)行組間比較,結(jié)果顯示各細(xì)胞亞群在總心肌細(xì)胞中的百分比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再將IRI不同時(shí)間點(diǎn)的各組細(xì)胞亞群百分比與假手術(shù)組進(jìn)行兩兩比較,在1～2天較對(duì)照組均有顯著升高(P<0.05),除1天時(shí)CD11c-Ly6C+單核細(xì)胞的7.06%較對(duì)照組的0.50%有升高趨勢(shì)(P=0.05,表2),各組的達(dá)峰時(shí)間在1～2天,7天時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平(圖3)。

LeukocyteShamIRI 1 dIRI 2 dIRI 4 dIRI 7 dχ2PCD45+0.90±0.2513.88±10.70(1)10.68±3.863.44±1.610.87±0.5117.620.001Q1 (CD11c+Ly6C-)0.24±0.171.63±1.233.05±1.01(1)1.49±0.980.18±0.0916.910.002Q2 (CD11c+Ly6C+)0.06±0.034.18±3.11(1)3.46±1.240.69±0.370.05±0.0218.010.001Q3 (CD11c-Ly6C+)0.50±0.167.06±5.953.33±1.680.96±0.110.36±0.2118.430.001Q4 (CD11c-Ly6C-)0.096±0.0391.01±0.69(1)0.83±0.320.3±0.160.068±0.03916.940.002

(1)vs.Sham,P<0.05.

圖3 各組細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比變化Fig 3 Percentage of cell populations in total heart cells in the sham-operated and IRI mice

討 論

本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)制備心肌組織的單個(gè)細(xì)胞懸液對(duì)小鼠心臟IRI模型的心肌DC進(jìn)行了定量分析,經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)明確其隨時(shí)間的變化規(guī)律。以CD45標(biāo)記缺血損傷時(shí)浸潤(rùn)心肌的白細(xì)胞,再以CD11c和Ly6C雙標(biāo)記研究了浸潤(rùn)細(xì)胞中的DC和單核細(xì)胞的標(biāo)記漂移情況,定量、直觀、動(dòng)態(tài)地表現(xiàn)出了心肌缺血1周的標(biāo)記轉(zhuǎn)變。對(duì)照組小鼠的心肌單個(gè)細(xì)胞懸液中白細(xì)胞比例低(CD45陽(yáng)性比例0.9%),以CD11c+和Ly6C+單陽(yáng)性細(xì)胞為主(CD11c-Ly6C+占56.72%、CD11c+Ly6C-占25.58%、CD11c+Ly6C+占6.87%、CD11c-Ly6C-占10.81%)。IRI后CD45+細(xì)胞比例明顯增加(術(shù)后1天時(shí)13.88%),Ly6C和CD11c標(biāo)記的4組細(xì)胞比例幾乎均顯著升高,1～2天時(shí)達(dá)峰,7天時(shí)恢復(fù)正常水平;在CD45+細(xì)胞中,CD11c和Ly6C雙標(biāo)記的細(xì)胞亞群分析提示Ly6C+CD11c+雙陽(yáng)性細(xì)胞升高最為明顯,相對(duì)比例在對(duì)照組為6.87%,術(shù)后2天時(shí)升至峰值32.7%,術(shù)后2天時(shí)和4天的相對(duì)比例亦均較對(duì)照組小鼠顯著升高,其他各細(xì)胞亞群的相對(duì)比例未見(jiàn)升高;由于該組細(xì)胞急劇升高,Ly6C+、CD11c+單陽(yáng)性細(xì)胞的相對(duì)比例有下降,各組的相對(duì)比例在7天時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。CD11c+Ly6C+雙陽(yáng)性細(xì)胞的急劇變化也是本研究的重要發(fā)現(xiàn)。

既往研究發(fā)現(xiàn),成年小鼠心臟消化后經(jīng)流式細(xì)胞檢測(cè)約56%為心肌細(xì)胞,27%為成纖維細(xì)胞,10%為血管平滑肌細(xì)胞,7%為內(nèi)皮細(xì)胞,而免疫炎癥細(xì)胞比例極低[8]。心肌缺血等損傷后白細(xì)胞向局部聚集浸潤(rùn),數(shù)量明顯增多。在本實(shí)驗(yàn)中小鼠心臟缺血再灌注模型的心肌CD45陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)在1天時(shí)達(dá)到高峰,達(dá)到對(duì)照組10余倍,之后減少,7天時(shí)恢復(fù)正常;在這一過(guò)程中CD11c+DC在心肌中也明顯增加,CD11c+Ly6C+細(xì)胞亞群在術(shù)后2天時(shí)達(dá)到峰值,提示DC在早期即參與IRI相關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)。既往小鼠心梗模型的心肌免疫熒光染色提示CD11c+DC在心梗后3天時(shí)增多,7天時(shí)達(dá)到高峰[9],較此次IRI模型中的達(dá)峰時(shí)間明顯延遲,考慮與不同的動(dòng)物模型有關(guān)(心梗與缺血再灌注);病理研究提示DC主要聚集在梗死心肌及梗死邊緣,非梗死區(qū)域的心肌DC并無(wú)增加[5,9],心梗和IRI模型的心肌改變均為局灶性,既往心梗動(dòng)物模型的DC分布規(guī)律可供參考,本實(shí)驗(yàn)中未包括病理學(xué)研究。由于病理學(xué)研究易受取材誤差干擾,且無(wú)法選擇多種抗體標(biāo)記,故本研究選擇將小鼠的完整心臟消化后獲得單個(gè)細(xì)胞懸液行流式細(xì)胞檢測(cè),可以更為精確地對(duì)目的細(xì)胞亞群進(jìn)行區(qū)分及定量研究。

缺血損傷相關(guān)的免疫炎癥反應(yīng)中DC的來(lái)源、標(biāo)記、功能仍存在爭(zhēng)議。心肌DC的來(lái)源可能為自外周遷移或細(xì)胞間相互轉(zhuǎn)換。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)嵌合體方法發(fā)現(xiàn)心梗后心肌CD11c+DC主要為自外周血遷移,去除DC導(dǎo)致心梗后28天小鼠的心功能下降,伴有白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞的浸潤(rùn)增多,促炎因子分泌增多,提示DC對(duì)心梗后炎癥反應(yīng)、心肌重構(gòu)具有保護(hù)作用[9]。小鼠腦IRI模型中發(fā)現(xiàn)24 h時(shí)缺血壞死腦組織邊緣的DC增多,主要為組織內(nèi)固有的DC[10]。小鼠腎臟IRI模型研究則發(fā)現(xiàn)DC的促炎功能,證實(shí)同時(shí)表達(dá)巨噬細(xì)胞標(biāo)記F4/80的DC是早期分泌TNF-α的主要來(lái)源[11]。我們的研究提示IRI相關(guān)炎癥發(fā)生后CD11c陽(yáng)性細(xì)胞增多,細(xì)胞表面標(biāo)記發(fā)生急劇變化;對(duì)照組小鼠心臟CD11c+Ly6C-較CD11c+Ly6C+細(xì)胞多,前者是后者的3～4倍,IRI后24 h比例發(fā)生逆轉(zhuǎn),同時(shí)表達(dá)單核細(xì)胞標(biāo)記Ly6C的DC (CD11c+Ly6C+)明顯增多,是前者的2～3倍,除了外周血向心肌組織的遷移,重疊的細(xì)胞表面標(biāo)記也提示可能存在細(xì)胞間相互轉(zhuǎn)變。在感染或炎癥性疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),局部浸潤(rùn)的單核細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為炎癥性DC,表面標(biāo)記為MHCⅡ+CD11b+CD11c+F4/80+Ly6C+,它同時(shí)與炎癥部位聚集的其他細(xì)胞,如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞及其他種類的DC,存在表面標(biāo)記的部分重疊。炎癥性DC可大量合成TNFα和iNOS參與炎癥反應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示CD11c+Ly6C+在IRI相關(guān)炎癥時(shí)明顯增多,相對(duì)比例最高,流式細(xì)胞檢測(cè)圖(圖2)提示細(xì)胞亞群之間相互延續(xù),DC與Ly6C標(biāo)記的單核細(xì)胞關(guān)系密切,故除了自外周遷移,細(xì)胞轉(zhuǎn)換也是可信的來(lái)源之一。雖然實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有進(jìn)行全面的細(xì)胞表面標(biāo)記研究,但CD11c+Ly6C+這樣的標(biāo)記組合也指向炎癥性DC。

本研究明確了CD11c+DC在小鼠心臟IRI模型中的動(dòng)態(tài)變化,同時(shí)研究了單核細(xì)胞表面標(biāo)記Ly6C,結(jié)果提示CD11c+Ly6C+DC在早期即明顯增多,提示可能存在DC與單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,DC參與IRI免疫炎癥的機(jī)制和功能還需要進(jìn)一步的研究。