錢 成 包 陽(yáng) 徐月娟 李玉濤 王 一 張艷紅 郭士成,6 趙振宏 李 強(qiáng) 盧大儒,8 金 力,8 王久存,8 吳俊杰,

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科 上海 200032; 2揚(yáng)州大學(xué)附屬醫(yī)院心胸外科 揚(yáng)州 225000;3南京市第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 南京 210003; 4復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,5校醫(yī)院 上海 200433; 6美國(guó)威斯康星州馬什菲爾德臨床研究所人類遺傳中心 馬什菲爾德 54449;7海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 上海 200433; 8復(fù)旦大學(xué)泰州健康科學(xué)研究院 泰州 225300 )

中國(guó)每年有73萬(wàn)肺癌新發(fā)患者和61萬(wàn)肺癌患者死亡,肺癌已成為我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。57%的肺癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2],5年生存率低于10%[3]。癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中DNA修復(fù)能力起關(guān)鍵作用[4],核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)是DNA修復(fù)的重要方式,該修復(fù)過(guò)程通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子ⅡH (transcription factor ⅡH,TFⅡH)與DNA修復(fù)組分相互作用[5-8]發(fā)揮DNA修復(fù)功能。

GTF2H1(general transcription factor ⅡH,polypeptide 1;p62)是TFⅡH的核心結(jié)構(gòu)組分之一,N-末端含pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域,中間含BSD1和BSD2結(jié)構(gòu)域,C-末端含3螺旋束基序[5-8]。苯并(a)芘二醇環(huán)氧化物處理人成纖維細(xì)胞導(dǎo)致DNA損傷,細(xì)胞中GTF2H1蛋白質(zhì)水平在1 h內(nèi)提升2倍以上[9];83例非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)組織與其癌旁組織相比較,GTF2H1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)至0.47倍[10]。

我們前期通過(guò)500例患者和517例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)GTF2H1基因rs3802967位點(diǎn)突變與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)(CT+TTvs.CC,P=0.024)[11]。本文報(bào)道擴(kuò)大樣本進(jìn)一步探索該位點(diǎn)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性。

資 料 和 方 法

研究對(duì)象2009年1月至11月收集海軍軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)泰州健康科學(xué)研究院肺癌患者外周血液樣本。納入標(biāo)準(zhǔn):病理組織學(xué)檢查確診的新發(fā)肺癌患者,無(wú)其他器官惡性腫瘤史,無(wú)年齡、性別限制。對(duì)照組按年齡、性別和地區(qū)進(jìn)行頻數(shù)匹配,選擇同一時(shí)期相應(yīng)社區(qū)健康體檢者的血液樣本。本研究通過(guò)復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),流行病學(xué)調(diào)查資料收集及血液樣本采集均獲得研究對(duì)象知情同意。

DNA提取及基因分型檢測(cè)采用Qiagen血液DNA提取試劑盒(德國(guó)Qiagen公司),提取全血基因組DNA?；蚍中蜋z測(cè)使用2×48-Plex SNP scanTM試劑盒[12-14]?；蚍中唾|(zhì)量控制按照質(zhì)量控制流程進(jìn)行,包括>95%的基因分型檢出率、重復(fù)檢出的基因型、內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照樣品檢測(cè)。

數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)分析人口統(tǒng)計(jì)變異值、人群吸煙狀況、家族癌癥病史、對(duì)照組與病例組等位基因頻率差異及哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)定律。分別采用等位基因模型、基因型模型、顯性模型和隱性模型進(jìn)行非條件Logistic回歸分析,計(jì)算比值比(odds ratios,OR)和95%CI,校正年齡、性別、吸煙狀況和家族病史。進(jìn)一步按年齡、性別、吸煙情況、家族史和肺癌組織學(xué)類型對(duì)各種模型分別進(jìn)行分析。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

樣本總體情況及基因分型結(jié)果本研究納入肺癌病例885例,其中腺癌403例,鱗癌290例,小細(xì)胞癌79例,其他類型113例;對(duì)照組896例。病例組和對(duì)照組在性別和年齡上無(wú)顯著差異,而病例組中吸煙者和有家族史者明顯多于對(duì)照組(表1)。GTF2H1基因rs3802967位點(diǎn)基因分型結(jié)果顯示TT基因型354個(gè),CT基因型921個(gè),CC基因型506個(gè),符合HWE定律(P=0.086),表明所調(diào)查群體無(wú)明顯影響遺傳平衡的因素,適合進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究。

rs3802967位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系通過(guò)多種模型分析GTF2H1基因rs3802967位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系(表2),rs3802967 C>T突變顯著增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)(校正后OR=1.428,95%CI:1.243～1.641,P=4.961×10-7)。Logistic回歸分析表明,與攜帶野生CC基因型個(gè)體相比,攜帶rs3802967 CT基因型(校正后OR=1.918,95%CI:1.521～2.423,P=4.068×10-8)和TT基因型(校正后OR=2.008,95%CI:1.505～2.685,P=2.286×10-6)個(gè)體患肺癌風(fēng)險(xiǎn)均明顯升高。顯性模型分析顯示,攜帶rs3802967 CT/TT基因型個(gè)體與攜帶野生CC基因型個(gè)體相比,肺癌風(fēng)險(xiǎn)上升1.943倍(校正后P=3.989×10-9)。

aχ2test;bIndependentttest.

表2 GTF2H1基因rs3802967位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)Tab 2 Association between GTF2H1 rs3802967 polymorphism and lung cancer susceptibility

aAdjusted by gender,age,smoking status and family history.

rs3802967位點(diǎn)多態(tài)性與肺癌易感性分層分析rs3802967突變等位基因在年齡大于60歲、男性、吸煙以及鱗癌患者中顯著增加肺癌風(fēng)險(xiǎn),其中顯性模型結(jié)果得到的關(guān)聯(lián)最顯著(表3)。其他模型分層分析表現(xiàn)出與顯性模型相似的結(jié)果(表4～6)。

男性中CT+TT個(gè)體肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)升高2.141倍(P=1.852×10-8),女性中無(wú)關(guān)聯(lián);吸煙者中CT+TT個(gè)體肺癌風(fēng)險(xiǎn)上升2.382倍(P=1.813×10-9),非吸煙者無(wú)關(guān)聯(lián);進(jìn)一步分層后,發(fā)現(xiàn)男性吸煙者中CT+TT個(gè)體與CC個(gè)體相比風(fēng)險(xiǎn)上升2.283倍(P=2.718×10-8),女性吸煙、女性非吸煙、男性非吸煙分層中rs3802967與肺癌易感性均無(wú)關(guān)聯(lián)(表3)。

60歲以上人群中CT+TT個(gè)體與CC個(gè)體相比,肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)增加2.228倍(校正后P=2.219×10-7);CT和TT基因型與肺癌易感性的相關(guān)性在無(wú)腫瘤家族史人群較有腫瘤家族史人群表現(xiàn)更顯著,且攜帶CT和TT基因型人群患鱗癌的風(fēng)險(xiǎn)更高(P=4.908×10-8)。病理類型-年齡、病理類型-家族史分層中,rs3802967在年長(zhǎng)者(P=9.386×10-6)、年輕者(P=2.095×10-3)、有腫瘤家族史者(P=6.391×10-4)及無(wú)腫瘤家族史者(P=1.855×10-5)中均與鱗癌風(fēng)險(xiǎn)上升相關(guān),而此位點(diǎn)與腺癌的關(guān)聯(lián)未在年輕者和有家族史人群中發(fā)現(xiàn)(表3)。

表3 肺癌風(fēng)險(xiǎn)與GTF2H1 rs3802967位點(diǎn)顯性模型關(guān)聯(lián)分層分析Tab 3 Stratification analysis of GTF2H1 rs3802967 and lung cancer risk in dominant model

aAdjusted by gender,age,smoking status and family history.

表4 肺癌風(fēng)險(xiǎn)與GTF2H1 rs3802967位點(diǎn)等位基因模型關(guān)聯(lián)分層分析Tab 4 Stratification analysis of GTF2H1 rs3802967 and lung cancer risk in allele model

aAdjusted by gender,age,smoking status and family history.

討 論

GTF2H1與XPC蛋白的C-末端和N-末端相互作用,參與TFIIH中其他蛋白亞基招募,啟動(dòng)NER修復(fù)過(guò)程發(fā)生[5]。GTF2H1基因 -1 796～805 bp為啟動(dòng)子區(qū)域,其中-78～-66 bp為表觀調(diào)控區(qū)域。Fantom等預(yù)測(cè)軟件提示-78～-68 bp為潛在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn),-78 bp為進(jìn)化保守位點(diǎn)。rs3802967位于該基因-79 bp,在啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)且緊鄰上述功能區(qū)域/點(diǎn)。 rs3802967 C>T熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)導(dǎo)入H1299人肺腺癌細(xì)胞系后熒光素酶活性增加,功能預(yù)測(cè)也提示其可以與轉(zhuǎn)錄因子AP-1結(jié)合[11],推測(cè)rs3802967 C>T改變GTF2H1表達(dá),進(jìn)而參與肺癌發(fā)生發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),rs3802967 CT+TTvs.CC總體上增加肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.024)[11]。本次擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)顯著增加肺癌易感性(P=3.989×10-9),年齡小于60歲、男性、吸煙、鱗癌亞組中也驗(yàn)證了前期研究結(jié)果。與前期研究不同的是,本研究還在年齡大于60歲、腺癌患者中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與肺癌易感性顯著關(guān)聯(lián);進(jìn)一步分析顯示男性吸煙者中肺癌患病風(fēng)險(xiǎn)顯著上升(P=2.718×10-8)。

aAdjusted by gender,age,smoking status and family history.

大型隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)吸煙者肺鱗癌患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[15]。香煙煙霧濃縮物處理后,肺成纖維細(xì)胞IMR-90和支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B內(nèi)XPC蛋白含量降低[16],煙草削弱了NER通路修復(fù)功能。本研究結(jié)果中吸煙、男性和男性吸煙者中rs3802967位點(diǎn)多態(tài)與肺癌風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān),其可能原因?yàn)閞s3802967 C>T突變與吸煙相互作用,調(diào)節(jié)GTF2H1基因轉(zhuǎn)錄水平,共同參與鱗癌發(fā)生發(fā)展。

表6 肺癌風(fēng)險(xiǎn)與GTF2H1 rs3802967位點(diǎn)隱性模型關(guān)聯(lián)分層分析Tab 6 Stratification analysis of GTF2H1 rs3802967 and lung cancer risk in recessive model

aAdjusted by gender,age,smoking status and family history.

前期研究中年長(zhǎng)者與肺癌無(wú)關(guān)聯(lián)[11],而本研究中年長(zhǎng)者rs3802967位點(diǎn)C>T肺癌風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。年長(zhǎng)者真皮成纖維細(xì)胞中XPA、ERCC3和PCNA等DNA修復(fù)酶的蛋白表達(dá)量降低,導(dǎo)致NER在內(nèi)的多種DNA修復(fù)途徑效率下降[17-18],NER修復(fù)下降可增加突變率和遺傳不穩(wěn)定性,提高癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),這已經(jīng)在罕見(jiàn)病(如遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌、著色性干皮病等)中得到了驗(yàn)證[19]。因此有理由推測(cè)患者隨著年齡的增加,DNA修復(fù)效率下降,與rs3802967共同促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,本研究結(jié)果表明GTF2H1基因rs3802967位點(diǎn)C>T突變顯著增加肺癌風(fēng)險(xiǎn),尤其是鱗癌患病風(fēng)險(xiǎn)。該位點(diǎn)突變還增加了年齡大于60歲、男性、有吸煙史、無(wú)家族史人群患肺癌的風(fēng)險(xiǎn)。rs3802967有望成為肺癌易感個(gè)體篩查參考指標(biāo),對(duì)于深入揭示肺癌的病理過(guò)程、研發(fā)肺癌治療有效手段有重要的臨床現(xiàn)實(shí)意義。