陳小燕 劉盡國 胡必杰 朱夢(mèng)嬋 陳翠翠 宋元林 潘 玨

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科, 2感染科 上海 200032)

大氣污染造成的健康危害日趨嚴(yán)重,WHO公布的2012年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示每年約370萬死亡人口與大氣污染密切相關(guān)[1]。而顆粒物(particulate matter,PM)是大氣污染的主要污染物,根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)當(dāng)量直徑可分為4類:總懸浮顆粒物,直徑≤100 μm;粗顆粒物(PM10),直徑≤10 μm;細(xì)顆粒物(PM2.5),直徑≤2.5 μm;超細(xì)顆粒物(PM0.1),直徑≤0.1 μm[2]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)屬于廣泛模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR),是連接固有免疫與適應(yīng)性免疫的橋梁。其中TLR2表達(dá)范圍最廣,其胞外段可識(shí)別病原/危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(pathogen/danger associated molecular patterns,PAMPs/DAMPs)分子。因此,TLR2不僅可識(shí)別病原微生物及產(chǎn)物,還參與機(jī)體對(duì)非感染因子所致的炎性組織損傷的識(shí)別,從而啟動(dòng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。目前已知TLR2胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑根據(jù)其胞內(nèi)接頭蛋白的不同分為髓樣分化因子88 (myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性和非MyD88依賴性。有研究發(fā)現(xiàn)[3]收集自北京的大氣PM可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞TLR2基因表達(dá),單核苷酸多態(tài)性分析顯示TLR2和TLR4基因多態(tài)性影響哮喘兒童對(duì)交通粉塵的敏感性,表明TLRs參與了PM的致病過程。但PM對(duì)氣道上皮TLR2模式識(shí)別受體及其相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)建立不同濃度PM急性暴露的體內(nèi)外模型,通過檢測TLR2、TLR4、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域受體家族(nucleotide oligomerization domain 1,NOD1)、MyD88、R激活激酶(R-activated kinase 1,IRAK1)、核轉(zhuǎn)錄因子蛋白65(p65/RelA)的基因表達(dá)變化,探討PM暴露對(duì)小鼠肺損傷的影響以及TLRs信號(hào)通路表達(dá)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株24只8～10周齡SPF 級(jí)的C57BL.6J雄性小鼠(復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),實(shí)驗(yàn)前12 h對(duì)小鼠禁食。本研究操作過程經(jīng)過復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并獲得批準(zhǔn)。正常人支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

主要實(shí)驗(yàn)器材與試劑ViiA7 Real-time PCR儀(美國Applied Biosystems公司),FACScan流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司),大氣PM SRM?1649b(美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所),兔抗小鼠TLR2一抗、兔抗人TLR2一抗(英國Abcam公司)。

方法

PM準(zhǔn)備 在生物安全柜無菌環(huán)境下,酒精棉球擦拭PM標(biāo)準(zhǔn)品玻璃瓶后打開,用已消毒的電子天平稱量160 mg,再配制成4 mg/mL PM溶液,分裝,4 ℃避光保存。SRM?1649b主要成分為多環(huán)方烴類PAHs,硝基多環(huán)芳烴,苯醚,多氯聯(lián)苯同系類,含氯有機(jī)農(nóng)藥,八氯莰烯同系物,多氯二苯并對(duì)二英,二苯并呋喃同系物和其他無機(jī)顆粒物質(zhì)[4]。

分組 小鼠隨機(jī)分為4組(每組6只):對(duì)照組(氣管滴注等體積PBS)、低濃度PM組(0.5 mg/kg)、中濃度PM組(2 mg/kg)和高濃度PM組(4 mg/kg)。暴露處理過程:腹腔注射2,2,2-三溴乙醇(20 mL/kg)麻醉小鼠,在透射燈下,經(jīng)氣管插管將事先預(yù)熱的PBS或大氣PM溶液(1 mL/kg)緩慢注入小鼠體內(nèi),連續(xù)暴露3天,每次間隔24 h,暴露處理結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)小鼠,用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測。

肺泡灌洗液細(xì)胞BALF分類計(jì)數(shù) 暴露處理結(jié)束24 h后,結(jié)扎右肺,氣管內(nèi)注入0.5 mL PBS對(duì)左肺進(jìn)行灌洗,反復(fù)抽吸3次,回收灌洗液量在0.4 mL左右。收集3次灌洗的液體后在4 ℃、1 000 r/min (r=15 cm)離心15 min。沉淀細(xì)胞重懸,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。各取100 μL余下的細(xì)胞懸液進(jìn)行HE染色,分類計(jì)數(shù)。

肺組織HE染色觀察病理學(xué)改變和評(píng)分 取小鼠肺組織,經(jīng)脫水、浸蠟和包埋處理后制成石蠟塊。組織切片機(jī)切薄片和脫蠟后用HE 染色、脫水、透明、封片,隨后進(jìn)行評(píng)分。光鏡下病理學(xué)評(píng)分基于以下要素:肺泡腔是否滲出、出血或塌陷,肺泡間隔纖維組織增生程度、炎癥細(xì)胞浸潤程度,是否血管增生、擴(kuò)張、出血等。嚴(yán)重程度按損傷面積進(jìn)行評(píng)分,采用1～5分制,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[5]具體如下:1分,正常;2分,損傷面積<25%;3分,損傷面積25%～50%;4分,損傷面積51%～75%;5分,損傷面積>75%。請(qǐng)2名病理科醫(yī)師隨機(jī)對(duì)切片進(jìn)行打分,每個(gè)樣品評(píng)估3張切片,各組評(píng)分的平均值作為最終評(píng)分。

免疫組化分析TLR2蛋白質(zhì)水平情況 小鼠石蠟包埋肺組織制作切片,加3%過氧化氫于玻片上10 min,枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù),山羊血清封閉后,加入TLR2抗體(1∶200),在4 ℃下孵育過夜。加入二抗孵育2 h,DAB顯色,封片,拍照。

PM細(xì)胞暴露模型 我們采用人支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B,將實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(0 μg/mL)和暴露組(分別使用濃度為50、200、400 μg/mL的PM暴露處理BEAS-2B細(xì)胞24 h),進(jìn)行后續(xù)PCR和流式細(xì)胞儀檢測。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative RT-PCR,qRT-PCR) Trizol法抽提總RNA,測定RNA濃度后,參照日本Toyobo公司ReverTra Ace qPCR RT Kit使用說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。參照日本Toyobo公司SYBR?Green Real-time PCR Master Mix進(jìn)行PCR。以GAPDH作為內(nèi)參照。根據(jù)Genebank序列,設(shè)計(jì)合成各引物,具體序列見表1。

表1 qRT-PCR反應(yīng)所用引物序列Tab 1 The primers sequence of qRT-PCR

Western blot檢測細(xì)胞TLR2和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)及其磷酸化蛋白(phosphorylated-NF-κB,p- NF-κB)表達(dá) 細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后,用 RIPA/PMSF 裂解細(xì)胞,BCA法對(duì)上清液總蛋白濃度進(jìn)行定量。將蛋白樣品及彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)分別加入SDS-PAGE凝膠加樣孔內(nèi),經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,封閉液封閉2 h,一抗4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗室溫孵育2 h,ECL顯影液顯影,蛋白條帶灰度使用Image Quant軟件進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR2的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組如下:空白對(duì)照組、同型對(duì)照組、對(duì)照組及不同濃度PM暴露組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加PM暴露處理24 h后,收集細(xì)胞,加一抗(稀釋度1∶200),冰上孵育30～60 min。加入2 mL的PBS,1 000 r/min (r=15 cm)離心5 min,重復(fù)2次。棄上清液,加入帶FITC的二抗(稀釋度1:200),冰上避光孵育30～60 min。加入至少2 mL的PBS重懸細(xì)胞2次,1 000 r/min (r=15 cm)離心5 min。棄上清液,加500 μL PBS重懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度。

結(jié) 果

BALF細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)由表2和圖1可見,各PM暴露組細(xì)胞總數(shù)均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且存在劑量依賴關(guān)系。細(xì)胞分類計(jì)數(shù)結(jié)果顯示,PM暴露組中性粒細(xì)胞絕對(duì)值和構(gòu)成比均明顯升高,并隨PM暴露劑量增加而增加;PM暴露組巨噬細(xì)胞絕對(duì)數(shù)增加,但構(gòu)成比隨PM暴露劑量增加而減少;淋巴細(xì)胞絕對(duì)值和構(gòu)成比的變化較小。

Groupsn Total cellsNeutrophilsMacrophagesLymphocytesControl615.60±0.630.85±0.2213.93±0.350.83±0.255.63%±1.61%91.46%±1.48%2.91%±0.46%0.5 mg/kg618.67±0.65(1)3.18±0.50(3)14.97±0.600.59±0.1519.72%±0.11%(3)77.79%±0.12%(3)2.49%±0.15% 2 mg/kg622.67±0.68(3)5.94±0.38(3)15.46±0.90(3)1.27±0.51(1)25.21%±0.69%(3)71.53%±0.62%(3)3.26%±0.13%4 mg/kg638.50±2.28(3)15.62±1.60(3)20.33±1.10(3)2.54±0.54(3)40.33%±2.34%(3)52.81%±1.54%(3)5.64%±0.46%(2)

vs. Control group,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.

A:Control group (PBS);B:Low-dose PM group (0.5 mg/kg);C:Medium-dose PM group (2 mg/kg);D:High-dose PM group (4 mg/kg).

圖1肺泡灌洗液細(xì)胞的HE染色(×400)
Fig1CellHEstaininginBALF(×400)

肺組織病理改變對(duì)照組(圖 2A)肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔無液體滲出,肺泡壁薄,間隔均勻一致,極少炎癥細(xì)胞浸潤;各PM暴露組(圖 2B-D)肺泡結(jié)構(gòu)塌陷,血管擴(kuò)張、充血、出血,肺泡間隔增厚,以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤支氣管血管周圍及肺泡間隔,特別是高濃度PM組(圖2D)肺泡結(jié)構(gòu)完全塌陷,大量以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤全肺,甚至出現(xiàn)部分肺實(shí)變。肺損傷的評(píng)分結(jié)果(圖2E):各PM暴露組肺損傷評(píng)分較對(duì)照組顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),上述結(jié)果表明PM暴露引起小鼠呼吸系統(tǒng)急性損傷。

A:Control group (PBS);B:Low-dose PM group (0.5 mg/kg);C:Medium-dose PM group (2 mg/kg);D:High-dose PM group (4 mg/kg).Hollow triangle shape represents dilating and congesting vessels.vs.Control group,(1)P<0.01,(2)P<0.001.

圖2小鼠肺組織HE染色(×100)及病理學(xué)評(píng)分
Fig2LungHEstaining(×100)andpathologyscore

免疫組化檢測肺組織TLR2蛋白質(zhì)水平對(duì)照組小鼠TLR2受體主要在支氣管上皮弱表達(dá);而PM組小鼠可見大量TLR2陽性炎性細(xì)胞浸潤以及TLR2在部分肺泡上皮細(xì)胞,特別是支氣管上皮高表達(dá)(圖3)。

人支氣管上皮細(xì)胞TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子表達(dá)與對(duì)照組比較,各PM暴露組TLR2、MyD88 、IRAK1、RelAmRNA水平均增加,呈濃度梯度依賴,且4個(gè)基因的變化趨勢(shì)一致(圖4A-D);而TLR4 mRNA水平在低濃度PM組較對(duì)照組增加,但在高濃度PM組則降低(圖4E);與對(duì)照組比較,NOD1 mRNA水平則在各暴露組的變化均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4F)。

A:Control group (PBS);B:Medium-dose PM group (2 mg/kg).Hollow triangle shape represents TLR2-positive bronchial epithelial cells;solid triangle shape represents TLR2-positive inflammation cells;arrow represents TLR2-positive alveolar epithelial cells.

圖3肺組織免疫組織化學(xué)染色檢測TLR2表達(dá)(×200)
Fig3TLR2expressionbyimmunochemistrystaininginlungtissue(×200)

vs.Control group,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.

圖4qRT-PCR檢測BEAS-2B細(xì)胞TLR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)分子表達(dá)
Fig4TLR2-relatedgeneexpressioninBEAS-2BcellsbyqRT-PCR

Westernblot檢測對(duì)照組TLR2/GAPDH的蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.37±0.04,50 μg/mL PM暴露組為0.56±0.07,200 μg/mL PM暴露組為0.98±0.10,400 μg/mL PM暴露組為1.82±0.20,各PM暴露組TLR2蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組表達(dá)增加，且呈濃度梯度依賴，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5,P<0.05)。對(duì)照組的p-NF-κB/t-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.28±0.04,50 μg/mL PM暴露組為0.63±0.08,200 μg/mL PM暴露組為1.14±0.15,400 μg/mL PM暴露組為0.95.±0.05,各PM暴露組p-NF-κB蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5,P<0.05)。

討 論

TLR2是識(shí)別病原微生物及危險(xiǎn)相關(guān)分子的重要受體,在上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核-吞噬細(xì)胞等細(xì)胞中表達(dá),為宿主免疫的重要發(fā)起者。關(guān)于PM暴露對(duì)氣道上皮TLR2表達(dá)的影響,國內(nèi)外文獻(xiàn)尚不多見。本實(shí)驗(yàn)首先通過建立PM急性暴露小鼠模型,觀察小鼠BALF炎性細(xì)胞數(shù)量和比例,并進(jìn)行肺組織病理學(xué)評(píng)分,結(jié)果顯示PM暴露小鼠BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量和比例增加,肺組織以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤,引起肺組織損傷。免疫組化結(jié)果顯示PM暴露增強(qiáng)了肺組織尤其是氣道上皮細(xì)胞TLR2的表達(dá)。

圖5 Western blot法檢測BEAS-2B細(xì)胞TLR2及NF-κB蛋白質(zhì)水平

A:The chart of the fluorescence intensity of TLR2 detected by flow cytometry;B:The statistical graph of the mean fluorescence intensity of TLR2.vs.Control group,(1)P<0.001.

圖6流式細(xì)胞術(shù)檢測BEAS-2B細(xì)胞TLR2膜蛋白的表達(dá)
Fig6ThemembraneproteinexpressionofTLR2inBEAS-2Bcellsbyflowcytometry

TLR2/TLR4與NOD1蛋白分屬哺乳動(dòng)物體內(nèi)兩類主要的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs),參與識(shí)別各種PAMPs/DAMPs。TLR2/TLR4主要通過MyD88依賴或者TRIF依賴的信號(hào)通路啟動(dòng)NF-κB轉(zhuǎn)錄,產(chǎn)生前炎癥因子引起細(xì)胞損傷[6]。NOD1作為胞內(nèi)模式識(shí)別受體,與TLR2相輔相成,當(dāng)病原微生物進(jìn)入胞內(nèi)后可被NOD1識(shí)別,通過NF-κB信號(hào)通路啟動(dòng)免疫應(yīng)答[7]。我們采用人支氣管上皮細(xì)胞在體外PM暴露模型,觀察TLR2/TLR4以及NOD1信號(hào)通路基因的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PM暴露可提高TLR2、MyD88、IRAK1、RelAmRNA水平,呈濃度梯度依賴,而且4個(gè)基因的變化趨勢(shì)一致。TLR4 mRNA水平在低濃度PM暴露組有所增加,但在高濃度組則降低,與TLR2 mRNA水平改變并不完全一致。NOD1 mRNA水平則不受PM影響。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)PM2.5暴露上調(diào)了大鼠肺組織TLR2/TLR4表達(dá)而參與博來霉素誘導(dǎo)肺纖維化的發(fā)生發(fā)展[8],與我們研究結(jié)果不完全一致。這可能是因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)采用的PM不只是PM2.5,還包含粒徑大于2.5 μm的PM,且檢測的是人支氣管上皮細(xì)胞的TLR2/TLR4表情況。但我們和國內(nèi)研究結(jié)果都可見TLR2在其中起重要的作用。緊接著我們的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)PM增加了人支氣管上皮細(xì)胞TLR2和p-NF-κB蛋白水平,與mRNA水平結(jié)果一致。IRAK1為MyD88的下游分子,RelA則為NF-κB的一個(gè)亞單位,其代表經(jīng)典的NF-κB激活[9]。以上結(jié)果表明TLR2而非TLR4或者是NOD1在大氣PM暴露損傷中起重要作用,且MyD88/IRAK1/NF-κB參與了TLR2在此過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

目前關(guān)于PM對(duì)TLR2/TLR4表達(dá)影響的結(jié)果并不統(tǒng)一。Shoenfelt等[10]研究發(fā)現(xiàn)TLR2敲除后,巨噬細(xì)胞對(duì)PM2.5的炎癥因子減輕,TLR4敲除則影響不大,但不包括對(duì)粗顆粒的反應(yīng)。過表達(dá)人胚胎腎293細(xì)胞TLR2基因后,則增強(qiáng)對(duì)PM2.5的炎癥反應(yīng),且MyD88在其中也起到重要作用,與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致。而有文獻(xiàn)報(bào)道亞洲沙塵暴顆粒本身對(duì)巨噬細(xì)胞TLR2和TLR4表達(dá)影響不大,而顆粒聯(lián)合肺炎克雷伯桿菌感染可增加TLR2表達(dá),抑制TLR4表達(dá)[11]。這些結(jié)果不一致可能與實(shí)驗(yàn)選擇動(dòng)物模型和細(xì)胞模型的不同以及暴露時(shí)間不同有關(guān)。

綜上所述,PM暴露于氣道上皮細(xì)胞,上調(diào)了TLR2膜蛋白質(zhì)水平,可能通過MyD88/IRAK1/RelA(NF-κB)信號(hào)通路激活氣道炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),引起或者加重肺損傷。因此,通過抑制TLR2的表達(dá)從而抑制炎性因子的瀑布式釋放,從源頭上減輕PM急性暴露所致的肺損傷,為臨床預(yù)防治療提供新的思路。