馬俊興，何俊峰，崔 燕，張 倩，劉鵬剛

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

隨著海拔的升高，空氣中的氧氣含量會逐漸減少，造成長期暴露于高海拔環(huán)境中的哺乳動物會發(fā)生高山病。而生活在海拔3 000～6 000 m 高寒地區(qū)的牦牛(Bosgrunniens)已具有適應這種高原低氧環(huán)境的穩(wěn)定遺傳學特性[1-3]。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor-related protein, LRP)為低密度脂蛋白受體家族中的一員,起初發(fā)現(xiàn)它主要與脂蛋白特別是殘余乳糜微粒的清除有關(guān),它有30多種配體分子,參與體內(nèi)多種生理和病理過程[4]。通過配體競爭結(jié)合研究發(fā)現(xiàn),與LRP的其他配體相比，結(jié)締組織生長因子CTGF對LRP有非常高的親合力；而其他配體與LRP具有中等親合力。目前,CTGF與LRP之間高親合力的機制尚不清楚,但這種高親合力提示，LRP會在介導CTGF的生物學效應方面起重要作用；經(jīng)基因敲除LRP基因缺陷細胞不能結(jié)合CTGF等研究證實,LRP是CTGF的受體,CTGF在細胞的快速內(nèi)吞和降解過程依賴LRP[5]。LRP6作為CTGF受體之一，不僅與CTGF結(jié)合，還參與發(fā)育[6]。VEGFR2又稱激酶功能區(qū)受體(kinase domain receptor，KDR),不僅是受體酪氨酸蛋白激酶。血管內(nèi)皮細胞生長因子型受體2(VEGFR2)同時還是VEGF的主要功能受體。作為受體型酪氨酸激酶，主要通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的通透性,促進細胞有絲分裂趨化作用以及新生血管的形成，除此之外，還在抗內(nèi)皮細胞凋亡、維持內(nèi)皮細胞存活方面發(fā)揮重要作用[7]。VEGFR2與肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡有關(guān)。CTGF和VEGF與低氧條件下的肺有著十分緊密的聯(lián)系[8-9]。國內(nèi)外許多學者對LRP6和VEGFR2在肺癌、非小細胞肺癌和大鼠肺內(nèi)的分布特點進行了研究[10-15]。本課題組之前對牦牛肺的組織結(jié)構(gòu)進行過較為詳細的研究[16-17]。研究表明,CTGF表達與分布是成年牦牛的基礎(chǔ)分布，成年牦牛肺并未發(fā)生典型的肺纖維化或肺動脈高壓的病理特征，即成年牦牛并未產(chǎn)生肺動脈高壓。而在低氧環(huán)境下能刺激初生牦牛肺內(nèi)VEGF含量增高，從而對牦牛的發(fā)育產(chǎn)生影響。但有關(guān)LRP6和VEGF在牦牛肺的分布特點未見報道。

本研究采用酶聯(lián)免疫吸附方法、Western blot和免疫組織化學，對LRP6和VEGFR2在初生、半歲、成年和老年牦牛肺準確分布位置和表達量進行觀察比較，為低氧環(huán)境下牦牛肺適應性結(jié)構(gòu)的形成和機理提供部分理論基礎(chǔ)，同時也為心肺疾病的治療、高原醫(yī)學和運動醫(yī)學的研究提供部分理論資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及材料

本試驗以牦牛為研究對象，分別采集新生(1～7日 齡)、半歲(5～6月齡)、成年(3～6歲)和老年(7～10 歲)健康牦牛肺組織樣品，每個年齡段各5頭 份，經(jīng)頸動脈放血處死后，迅速采集肺膈葉的肺組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，脫水、石蠟包埋，切片厚4 μm。其中新生牦牛購自甘肅省甘南自治州，其余組別牦牛購自青海省西寧市。

1.2 ELISA檢測

1.2.1 材料 ELISA試劑盒購于武漢基因美生物科技有限公司(LRP6，JYM0135Bo；VEGFR2，JYM0139Bo)。

1.2.2 蛋白樣品的提取 采集組織樣本后，稱重。加入一定量的PBS(pH7.4)。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨?，仍然保?～8 ℃的溫度。加入一定量的PBS(pH7.4)，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心5 min(2 000～3 000 r·min-1)。收集上清液。分裝后，1份備用，其余-20 ℃冷凍保存。

1.2.3 方法 采用雙抗夾心ELISA法，用純化的LRP6和VEGFR2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被抗體的微孔中依次加入LRP6和VEGFR2，再與HRP標記的LRP6和VEGFR2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標記抗體復合物，經(jīng)過徹底洗滌后，加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)為藍色。用酶標儀在450 nm波長下的測定吸光值(OD值)，通過標準曲線計算樣本中LRP6和VEGFR2濃度。

1.3 Western-blot檢測

1.3.1 蛋白樣品的制備 取各個年齡段牦牛肺組織樣品各0.1 g，分別加入等量的組織均質(zhì)緩沖液(1 mLRIPA+10 μLPMSF)，冰浴搖勻2 h，然后4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 方法 取各年齡段牦牛肺的總蛋白各60 μL，分別加入20 μL溴酚藍混勻，100 ℃煮10 min，冰上5 min，然后將蛋白進行SDS-PAGE,再用濕轉(zhuǎn)法將其電極轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜(NC)上，從正極～負極的順序按4層濾紙、NC膜、凝膠塊、4層濾紙的順序擺放整齊，然后經(jīng)50 g·L-1脫脂奶粉溶液室內(nèi)封閉1.5 h，分別用LRP6和VEGFR2抗體4 ℃過夜孵育，用HRP標記山羊抗小鼠IgG溫孵育1.5 h，每步完成后,用PBST洗膜，每次洗10 min，最后用ECL避光顯色，X光顯影、定影。掃描蛋白印跡條帶。

1.4 免疫組織化學檢測

1.4.1 抗體及檢測系統(tǒng) 抗體和SP試劑盒均購自北京博奧森生物科技有限公司(Rabbit Anti-LRP6，bs-2905R；Rabbit Anti-VEGFR2，bs-10412R)；DAB 顯色試劑盒購自中杉金橋公司。

1.4.2 免疫組織化學染色 石蠟切片貼于免疫組化防脫切片上。60 ℃烘片4～6 h。切片脫蠟至水，蒸餾水浸泡5 min，PBS浸泡5 min。按照試劑盒說明書步驟進行處理，DAB顯色。LRP6多克隆抗體和VEGFR2多克隆抗體均按照1∶400稀釋后使

用，空白對照用0.01 mol·L-1的PBS代替一抗。

1.4.3 結(jié)果判定 以陽性表達強度為判定標準。深棕黃色為強陽性表達，淺棕黃色為陽性表達，淺黃色為弱陽性表達，接近背景色或無色為陰性。照片均通過Olympus-BX51生物顯微鏡和Olympus DP73照相系統(tǒng)進行拍攝。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 雙抗體夾心ELISA檢測LRP6和VEGFR2在牦牛肺的濃度

由表1和圖1A可知，LRP6在初生和半歲的濃度均差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年的LRP6濃度值均差異顯著(P<0.05)，成年和老年的LRP6濃度差異顯著(P<0.05)。由表1和圖1B可知，VEGFR2在初生和半歲的濃度差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年的VEGFR2濃度差異均顯著(P<0.05)，成年和老年的VEGFR2濃度差異顯著(P<0.05)。

表1LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺的濃度

Table1TheconcentrationofLRP6andVEGFR2inthelungofyaksatdifferentages

年齡 Age初生Newborn半歲Juvenile成年Adult老年Old LRP6 /(pg·mL-1)133.357±3.341c143.272±4.321c190.278±2.935b242.323±1.987aVEGFR2 /(mg·mL-1)136.028±2.414c140.074±3.040c173.378±4.186b241.954±3.909a

同一行字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，同一行字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

Different letters mean significant differences in the same row among different groups (P<0.05), same letters mean no difference in the same row among different groups (P>0.05)

不同年齡組間，字母不同代表組間差異顯著(P<0.05)，字母相同代表組間差異不顯著(P>0.05)。下同Different letters mean significant differences among diferent age groups (P<0.05), same letters mean no difference among diferent age groups (P>0.05).The same as below圖1 LRP6(A)和VEGFR2(B)在不同年齡牦牛肺的濃度Fig.1 The concentration of LRP6 (A) and VEGFR2(B) in the lung of yaks at different ages

2.2 Western-blot檢測LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺的表達

由圖2B可知，LRP6在初生和半歲牦牛肺的表達均差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年牦牛肺LRP6表達均差異顯著(P<0.05)，成年和老年牦牛肺LRP6表達差異顯著(P<0.05)。由圖2C可知，在初生和半歲牦牛肺VEGFR2表達差異不顯著(P>0.05)，初生、半歲與成年和老年牦牛肺VEGFR2表達均差異顯著(P<0.05)，成年和老年牦牛肺VEGFR2表達差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組織化學觀察LRP6和VEGFR2在不同年齡牦牛肺中的分布與表達

2.3.1 LRP6在牦牛肺的分布和表達情況 LRP6在初生和半歲年齡段牦牛肺的分布和表達量基本一致，在細支氣管(圖3a)、終末細支氣管(圖3b)、呼吸性細支氣管(圖3c)上皮細胞中以及肺泡

A. Western-blot結(jié)果; B. LRP6; C. VEGFR2A.The result of Western-blot; B. LRP6; C. VEGFR2圖2 不同年齡中LRP6和VEGFR2蛋白在牦牛肺的表達Fig.2 The expressions of LRP6 and VEGFR2 protein in yak lung at different ages

Ⅱ型細胞中(圖3d)呈弱陽性表達，在細支氣管動脈(圖3a)、伴行肺動脈(圖3b)內(nèi)膜上皮細胞和平滑肌也有分布，呈陽性表達。成年牦牛肺細支氣管(圖3e)、終末細支氣管(圖3f)上皮細胞和肺泡Ⅱ型細胞成陽性表達，呼吸性細支氣管(圖3g)上皮細胞的表達和初生以及半歲基本一致。而在老年牦牛肺細支氣管(圖3h)、終末細支氣管(圖3i)、呼吸性細支氣管(圖3j)上皮細胞呈強陽性表達，在細支氣管肺動脈和肺泡Ⅱ型細胞(圖3k)中也有大量分布，呈強陽性表達。圖3l為空白對照。

2.3.2 VEGFR2在牦牛肺的分布情況 VEGFR2在初生和半歲年齡段牦牛肺的分布和表達量也基本一致，在細支氣管(圖4a)、終末細支氣管(圖4b)、呼吸性細支氣管(圖4c)上皮細胞中和平滑肌細胞以及肺泡Ⅰ型細胞中(圖4d)呈弱陽性表達，在細支氣管動脈(圖4a)、伴行肺動脈(圖4b)內(nèi)膜細胞也有分布，也呈弱陽性表達。在成年牦牛肺在細支氣管(圖4e)上皮和管壁平滑肌中強陽性表達；在終末細支氣管(圖4f)只有上皮有陽性表達及管壁平滑肌中無表達；在呼吸性細支氣管(圖4g)和Ⅰ型肺泡上皮細胞和肺泡隔細胞(圖4h)內(nèi)強陽性表達。在伴行肺動脈血管壁平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞陽性表達(圖4f)。而在老年牦牛肺細支氣管(圖4i)、終末細支氣管(圖4j)、呼吸性細支氣管上皮和管壁平滑肌中以及Ⅰ型肺泡上皮細胞和肺泡隔細胞(圖4k)上皮細胞呈強陽性表達，圖4l為空白對照。

a.初生牦牛肺細支氣管及肺動脈；b.半歲牦牛肺終末細支氣管及伴行動脈；c.初生牦牛肺呼吸性細支氣管；d.半歲牦牛肺泡囊；e.成年牦牛肺細支氣管及肺動脈；f.成年牦牛肺終末細支氣管及伴行動脈；g.成年牦牛肺呼吸性細支氣管；h.老年牦牛肺細支氣管及肺動脈；i.老年牦牛肺終末細支氣管及伴行動脈；j.老年牦牛肺呼吸性細支氣管；k.老年牦牛肺泡囊；l.空白對照。B.細支氣管；TB.終末細支氣管；RB.呼吸性細支氣管；PA.肺動脈；AS.肺泡囊。下同a.Newborn yak lung bronchioles and pulmonary arteries; b.Juvenile yak lung terminal bronchiole and accompanying artery; c.Newborn yak lung respiratory bronchioles; d.Juvenile yak lung alveolar sac; e.Adult yak lung bronchioles and pulmonary arteries; f.Adult yak lung terminal bronchioles and accompanying arteries; g. Adult yak lung respiratory bronchioles; h.Old yak lung bronchioles and pulmonary arteries; i.Old yak lung terminal bronchioles and accompanying artery; j.Old yak lung respiratory bronchioles; k.Old yak lung alveolar; l. The blank control; B.Bronchioles; TB.Terminal bronchioles; RB. Respiratory bronchioles; PA.Pulmonary artery; AS.Alveolar sacs. The same as below圖3 免疫組織化學染色檢測LRP6在不同年齡牦牛肺的表達(a、c、d、e、g、h、i、k、l:400×；b、f、j：200×)Fig.3 Immunohistochemical expression of LRP6 in the lung of yak at different ages(a,c,d,e,g,h,I,k,l：400×；b,f,j：200×)

表2LRP6在不同年齡牦牛肺中的表達情況

Table2TheLRP6expressioninthelungatdifferentagesyak

年齡Age細支氣管Bronchioles肺動脈Pulmonary artery終末細支氣管Terminal bronchiole上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle內(nèi)膜Ti中膜Tm外膜Ta上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle呼吸性細支氣管Respiratorybronchiole肺泡囊Alveolar sacs初生 Newborn+++-+++++半歲Juvenile+++-+++++成年Adult++++++++++++老年Old++++++++++++++

+++.強陽性表達；++.陽性表達； +.弱陽性表達；-.陰性表達。下同

+++.The strong positive expression; ++.The positive expression; +.The weak positive expression; -.The negative expression. The same as below

圖4 免疫組織化學染色檢測VEGFR2在不同年齡牦牛肺的表達(a、c、d、e、g、h、i、k、l:400×；b、f、j:200×)Fig.4 Immunohistochemical expression of VEGFR2 in the lung of yak at different ages(a,c,d,e,g,h,i,k,l:400×；b,f,j:200×)

表3VEGFR2在不同年齡牦牛肺中的表達情況

Table3TheVEGFR2expressioninthelungatdifferentagesyak

年齡Age細支氣管Bronchioles肺動脈Pulmonary artery終末細支氣管Terminal bronchiole上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle內(nèi)膜Ti中膜Tm外膜Ta上皮Epithelium管壁平滑肌Smooth muscle呼吸性細支氣管Respiratorybronchiole肺泡囊Alveolar sacs初生Newborn+++++++++半歲Juvenile+++-+++++成年Adult+++++++++++老年Old++++++++++++++

3 討 論

VEGFR2廣泛存在于正常機體的組織器官中。筆者觀察到肺內(nèi)VEGFR2主要分布于肺泡Ⅱ型細胞，支氣管上皮細胞、肺血管平滑肌細胞、成纖維細胞、肺泡巨噬細胞及肺血管內(nèi)皮細胞也有VEGFR2表達。生長發(fā)育過程中，肺組織內(nèi)皮血管增生、遷移、出芽、新生心血管形成與細胞外基質(zhì)重塑都需要VEGFR2參與[18]。有研究證實在新生大鼠予以VEGFR2受體拮抗劑后肺組織內(nèi)皮細胞凋亡增加，出現(xiàn)肺氣腫樣病變[19]。VEGFR2與血導管、血管形成和造血有關(guān)。提示VEGFR2是血導管生成的主要調(diào)控因子[20]。Hanahan和Folkman[21]1996年提出了“血管形成的開關(guān)平衡假說”，認為血管生成受多種促進因子和血管生成抑制因子的共同調(diào)控，當生長因子的濃度下降時，開關(guān)處于開放狀態(tài)導致血管形成。成年時期由于肺部血管內(nèi)皮細胞增生不活躍，此時VEGFR2可能對維持肺血管的正常生理功能起一定的作用。VEGFR2是血管生長和發(fā)育的主要調(diào)節(jié)者，它們不僅在內(nèi)皮細胞上有表達，在非內(nèi)皮細胞上也有表達。說明VEGFR2可能在維持正常生理狀況及抗損傷修復中發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，牦牛肺組織中的VEGFR2表達也逐漸上升，本研究結(jié)果與Hanahan和Folkman[21]對血管內(nèi)皮生長因子及其受體在大鼠肺發(fā)育過程中的表達研究結(jié)果不同，大鼠肺內(nèi)VEGFR2不僅在胎兒及新生兒肺內(nèi)表達,以后也持續(xù)存在,但水平很低。這可能表明牦牛隨著年齡的增長，肺組織中內(nèi)皮細胞增生、遷移能力顯著上升,其抗損傷能力也隨之上升。肺內(nèi)VEGFR2逐漸增加以滿足其生長需要，說明可能與牦牛所處的高原低氧環(huán)境有關(guān)系。

LRP6是Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑必不可少的受體[6]，通過LRP6抑制Wnt信號傳導降低了肺癌細胞體內(nèi)自我更新的能力[22]。Wnt信號途徑是胚胎早期發(fā)育過程中調(diào)控細胞生長、發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑，使細胞沿著某一方向定向分裂，使新產(chǎn)生的細胞定位于某個區(qū)域，決定著細胞分化的命運[23]， 并在涉及肺癌發(fā)展的多個過程中發(fā)揮作用[24]。LRP6與結(jié)締組織生長因子CTGF有高度的結(jié)合能力，證實LRP6是CTGF的受體之一[5]。筆者觀察到LRP6在牦牛不同發(fā)育時期肺組織中支氣管上皮細胞、平滑肌細胞和肺動脈等也均有表達。這與Wang等[25]對Wnt信號傳導通過LRP6作用激活上皮細胞和血管平滑肌細胞的研究結(jié)果相似。隨著已有大量研究報道LRP6作為Wnt信號傳導的受體可調(diào)節(jié)肺上皮細胞和內(nèi)皮細胞的黏附、增殖、遷移和生長促進血管生長和細胞外基質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)血管生成因子的產(chǎn)生或活性，并參與直接和間接的血管生成調(diào)節(jié)機制，從而引起肺動脈和小動脈重塑[26-28]。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明：1)在分布區(qū)域上，VEGFR2和LRP6均在肺內(nèi)支氣管及其分支的上皮細胞、平滑肌細胞表達較高。2)在年齡方面，LRP6和VEGFR2在牦牛肺組織中表達豐富且在不同年齡段的表達有差異。說明這2種因子可能共同作用于牦牛肺細胞，促進肺動脈重建以抵抗高原低氧對肺的損傷。為進一步研究高原低氧對牦牛肺的損傷，還需對牦牛肺進行更深入的研究，從而為探索治療肺疾病提供新的思路。