田衛(wèi)軍，秦嘉玲，岳嬋娟，侯冉冉，劉寬輝，胡元亮*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)研究室，南京 210095；2. 富陽區(qū)畜牧獸醫(yī)局，杭州 311400)

機(jī)體內(nèi)正常有氧代謝產(chǎn)生的自由基，也稱活性氧，如超氧化自由基、過氧化氫自由基等，種類繁多。這些自由基會(huì)攻擊DNA、蛋白質(zhì)，損傷其結(jié)構(gòu)，造成細(xì)胞損傷或突變，激活癌基因或使抗癌基因失活，從而使細(xì)胞失去控制，引發(fā)一系列疾病[1]。肝是機(jī)體重要的解毒器官，酒精、藥物、生物制劑以及化學(xué)藥物的使用均有可能導(dǎo)致肝細(xì)胞氧化損傷[2]。有研究表明[3]，桑葚多糖具有保護(hù)H2O2損傷后細(xì)胞膜的完整性、降低損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平、提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性和抑制脂質(zhì)過氧化的作用。中藥多糖作為一種抗氧化劑，能夠清除機(jī)體內(nèi)過多的自由基，維護(hù)機(jī)體的健康，對(duì)提高動(dòng)物疫病的防控效果、保障畜牧養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義[4-6]。

本試驗(yàn)根據(jù)前期研究結(jié)果，選取枸杞多糖(Lycumbarbarumpolysaccharide, LBP)、白術(shù)多糖(Atractylodesmacrocephalapolysaccharide, AMP)、當(dāng)歸多糖(ChineseAngelicapolysaccharide, CAP)作為研究對(duì)象，以維生素C(vitamin C, VC)為對(duì)照，首先測(cè)定對(duì)雞胚肝細(xì)胞(chicken embryo liver cells, CEL)的安全濃度，然后取安全濃度范圍內(nèi)3種濃度的各多糖，加入到CEL的培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)24 h后用H2O2攻擊，測(cè)定CEL活力、肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量、GSH-Px和SOD活性的變化。本試驗(yàn)的目的，旨在驗(yàn)證中藥多糖對(duì)CEL抗氧化能力的影響，篩選出抗氧化作用最強(qiáng)的多糖，為研制多糖類抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 多糖與主要試劑

LBP、AMP、CAP和VC，由本實(shí)驗(yàn)室提供。先用去離子水稀釋成4 mg·mL-1，煮沸30 min滅菌，4 ℃保存，臨用前用DMEM細(xì)胞維持液自4 000 μg·mL-1倍比稀釋至3.91 μg·mL-1，共11個(gè)濃度。

DMEM培養(yǎng)基(SIGMA)，用三蒸水配制，加入2%的雙抗(青、鏈霉素各100 IU·mL-1)、1%的胰島素和2%的谷氨酰胺，作為細(xì)胞維持液，另加10%的胎牛血清作為細(xì)胞生長(zhǎng)液。MTT，Amresco Co產(chǎn)品，用pH7.4的PBS配成5 mg·mL-1。胰酶(BIOSHARP)，取2.5 g溶于1 000 mL PBS配成2.5 mg·mL-1。以上試劑均用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌。DMEM維持液和MTT 4 ℃保存，MTT且避光保存，胰酶-20 ℃保存。

H2O2液的配制：取30% H2O2(濃度為10 mol·L-1) 1 mL加入到49 mL PBS中，配成濃度為200 mmol·L-1的初始液，然后用細(xì)胞維持液倍比稀釋成11個(gè)濃度。預(yù)試驗(yàn)測(cè)定1.562 5～25 mmol·L-1與空白對(duì)照無顯著差異，選擇25 mmol·L-1作為作用細(xì)胞濃度。

雞胚肝細(xì)胞ROS、SOD、GSH-Px測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.2 雞胚肝細(xì)胞的制備

取12胚齡雞胚，用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗3次，剖腹取出肝，用冷PBS洗液漂洗3次，剪碎研磨成約1 mm3大小的小塊，再用冷PBS洗液中漂洗3～4次。加入0.25%的胰酶液消化3～5 min；棄去胰酶液，用胎牛血清滅活胰酶，胰酶消化反應(yīng)終止后，加入細(xì)胞維持液，用大口吸管吹散細(xì)胞，1 000 r·min-1離心10 min。棄去上清液，取沉淀，加入適量細(xì)胞生長(zhǎng)液，用吸管吹勻，用細(xì)胞篩過濾。活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于90%后，備用。

1.3 藥物對(duì)雞胚肝細(xì)胞安全濃度的測(cè)定

用MTT法測(cè)定雞胚肝細(xì)胞安全濃度。將肝細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)·mL-1，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37.5 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，去除紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。然后分別加入11個(gè)濃度的多糖和VC，每孔100 μL，每濃度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(CC，僅加細(xì)胞生長(zhǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h取出，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后離心棄上清，每孔加裂解液DMSO 100 μL，將細(xì)胞板置于微量振蕩器上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)570 nm處的吸光度(A570 nm)值。選擇A570 nm值不顯著小于細(xì)胞對(duì)照組的多糖最大安全濃度作為該多糖的最大安全濃度。

1.4 雞胚肝細(xì)胞活力的測(cè)定

將肝細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)·mL-1，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37.5 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，棄去上清液，根據(jù)安全濃度的測(cè)定結(jié)果分別加入1 000、500、250 μg·mL-13個(gè) 濃度的多糖和VC，每孔100 μL，每個(gè)濃度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(CC)和H2O2對(duì)照組(均加細(xì)胞生長(zhǎng)液100 μL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除CC組外每孔加H2O250 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加裂解液DMSO 100 μL，將細(xì)胞板置于微量振蕩器上振蕩5 min使沉淀完全溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)570 nm處的吸光度(A570 nm)值，作為雞胚肝細(xì)胞活力的指標(biāo)。

1.5 雞胚肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

肝細(xì)胞密度、接種、培養(yǎng)、加藥同肝細(xì)胞活力測(cè)定，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除CC組外每孔加H2O250 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，取出細(xì)胞板，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗液洗3次，然后加入20 μmol·L-1DCFH-DA 5 μL，避光反應(yīng)30 min，用PBS洗滌兩次，最后加入50 μL PBS，取細(xì)胞板用熒光酶標(biāo)儀測(cè)定ROS的含量。

1.6 雞胚肝細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性的測(cè)定

將懸浮的肝細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個(gè)·mL-1，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2 mL，置于37.5 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，24 h后棄去上清液，每孔加入1 mL細(xì)胞生長(zhǎng)液，然后分別加入1 000、500、250 μg·mL-13個(gè)濃度的多糖和VC，每孔1 mL，每個(gè)濃度重復(fù)4孔，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照組(CC)和H2O2對(duì)照組(加細(xì)胞生長(zhǎng)液1 mL)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除CC組外每孔加H2O2500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，取出細(xì)胞板，吸取細(xì)胞上清液用試劑盒測(cè)定雞胚GSH-Px的活性。

1.7 雞胚肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性的測(cè)定

肝細(xì)胞密度、接種、培養(yǎng)、加藥同GSH-Px活性測(cè)定，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，除CC組外每孔加H2O2500 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗液洗2次，吸去上清，用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下，收集到2 mL EP管中，加入500 mL PBS，冰水浴，功率300 W進(jìn)行超聲破碎，每5 s超聲1次，間隔4次，每次間隔時(shí)間為25 s，取細(xì)胞勻漿用試劑盒測(cè)定SOD活性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 藥物對(duì)雞胚肝細(xì)胞的安全濃度

結(jié)果見表1。LBP、AMP和VC在1 000 μg·mL-1組、CAP在2 000 μg·mL-1組的細(xì)胞A570 nm值不顯著小于細(xì)胞對(duì)照組，可將這些濃度定為它們的最大安全濃度。為便于同水平比較，將它們的最大安全濃度統(tǒng)一設(shè)為1 000 μg·mL-1。

2.2 各組雞胚肝細(xì)胞活力的變化

各組的A570 nm值見表2。H2O2組的細(xì)胞A570 nm值最小，顯著小于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)；4個(gè)藥物組的細(xì)胞A570 nm值均高于H2O2組，LBP在1 000 和500 μg·mL-1、AMP在1 000 μg·mL-1、CAP和VC在3個(gè)濃度組的A570 nm值均顯著大于H2O2組(P<0.05)，表明它們?cè)谶@些濃度能顯著抵抗H2O2引起的細(xì)胞活力降低。

2.3 各組雞胚肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量的變化

各組雞胚肝細(xì)胞內(nèi)ROS的含量見表3。H2O2組的ROS含量最高，顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)。4個(gè)藥物組的ROS含量多低于H2O2組，LBP和VC的3個(gè)濃度組、AMP和CAP在1 000和500 μg·mL-1組的ROS含量顯著低于H2O2組(P<0.05)，表明它們?cè)谶@些濃度能顯著抑制H2O2引起的ROS升高。

2.4 各組雞胚肝細(xì)胞內(nèi)GSH-Px活性的變化

各組雞胚肝細(xì)胞內(nèi)GSH-Px的活性見表4。H2O2組的GSH-Px活性最低，顯著低于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)。4個(gè)藥物組的GSH-Px活性均高于H2O2組，LBP和VC的3個(gè)濃度組、AMP和CAP在1 000和500 μg·mL-1組的GSH-Px活性顯著高于H2O2組(P<0.05)；LBP和VC在1 000和500 μg·mL-1、AMP和CAP在1 000 μg·mL-1組的GSH-Px活性顯著高于CC組(P<0.05)，表明它們?cè)谶@些濃度不但能顯著抑制H2O2引起的GSH-Px活性降低，而且能顯著提升GSH-Px活性超過正常水平。

質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) ConcentrationLBPAMPCAPVC4 0000.235±0.012f0.516±0.010i0.614±0.017i3.106±0.013a2 0000.229±0.014f0.706±0.014h0.739±0.006e2.665±0.036b1 0000.851±0.005c0.846±0.010c0.855±0.003c1.379±0.060c5000.877±0.041b0.958±0.010a0.991±0.018a0.927±0.020d2500.914±0.022a0.875±0.011b0.915±0.015b0.937±0.009d1250.850±0.013c0.858±0.011c0.860±0.009c0.863±0.011e62.50.804±0.012d0.811±0.011d0.851±0.004c0.855±0.023e31.250.831±0.014c0.805±0.011de0.756±0.005d0.794±0.019f15.630.807±0.011d0.793±0.014e0.715±0.015fg0.725±0.017g7.820.798±0.007d0.776±0.002f0.701±0.005h0.722±0.013g3.910.743±0.009e0.757±0.008g0.700±0.007h0.711±0.013g0(細(xì)胞對(duì)照,cell control)0.739±0.001e0.768±0.006fg0.718±0.007f0.698±0.006g

LBP.枸杞多糖；AMP.白術(shù)多糖；CAP.當(dāng)歸多糖；VC.維生素C。同列數(shù)據(jù)標(biāo)不同字母者差異顯著(P<0.05)，以下表同

LBP.Lycumbarbarumpolysaccharide; AMP.Atractylodesmacrocephalapolysaccharide; CAP.ChineseAngelicapolysaccharide; VC. Vitamin C.Column data without the same superscripts differ significantly (P<0.05). The same as following tables

組別 Group藥物質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) ConcentrationLBPAMPCAPVC藥物組1 0000.705±0.004b0.616±0.014cd0.639±0.011c0.850±0.019aDrug group5000.633±0.004c0.511±0.007f0.600±0.013d0.635±0.006c2500.509±0.010f0.506±0.006f0.559±0.017e0.562±0.022eH2O2對(duì)照組 H2O2 control group0.487±0.026f細(xì)胞對(duì)照組(CC) Cell control group0.853±0.007a

U·mL-1

組別 Group藥物質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) ConcentrationLBPAMPCAPVC藥物組1 00037.04±0.37a31.11±0.64b29.63±0.74b36.84±0.68aDrug group50029.63±0.98b26.30±1.34c25.93±0.37c35.93±0.98a25025.56±1.28c21.11±0.64d18.52±0.98d26.37±0.18cH2O2對(duì)照組 H2O2 control group17.78±0.64d細(xì)胞對(duì)照組(CC) Cell control group24.81±0.98c

2.5 各組雞胚肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性的變化

各組雞胚肝細(xì)胞內(nèi)SOD的活性見表5。H2O2組的SOD活性最低，顯著低于細(xì)胞對(duì)照組(P<0.05)。4個(gè)藥物組的SOD活性均高于H2O2組，LBP、CAP和VC的3個(gè)濃度組、AMP在1 000和500 μg·mL-1組的SOD活性均顯著高于H2O2組(P<0.05)；LBP和VC的3個(gè)濃度組、AMP在1 000 μg·mL-1和CAP在1 000和500 μg·mL-1組的SOD活性顯著高于CC組(P<0.05)，表明它們?cè)谶@些濃度不但能顯著抑制H2O2引起的SOD活性降低，而能顯著提高SOD活性(P<0.05)至超過正常水平。

組別 Group藥物質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) ConcentrationLBPAMPCAPVC藥物組1 000410.20±0.71b394.29±1.87e396.73±0.71d423.45±1.43aDrug group500405.71±1.22c388.16±0.71f394.29±0.71e422.86±1.22a250397.96±0.71d368.16±1.87h382.86±0.71g396.89±1.01dH2O2對(duì)照組 H2O2 control group366.12±1.87h細(xì)胞對(duì)照組(CC) Cell control group386.12±1.22f

3 討 論

3.1 多糖對(duì)雞胚肝細(xì)胞活力的影響

H2O2是一種重要活性氧，高濃度的H2O2可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其極易透過細(xì)胞膜，可與胞內(nèi)的鐵離子反應(yīng)形成高活性的自由基，從而誘發(fā)一系列反應(yīng)。由于H2O2具有性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定、容易獲得等優(yōu)點(diǎn)，常作為細(xì)胞氧化損傷研究的重要工具[7-9]，因此本試驗(yàn)采用H2O2誘發(fā)雞胚肝細(xì)胞氧化損傷，測(cè)定細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)ROS含量和抗氧化酶活性的變化。結(jié)果顯示，H2O2組的細(xì)胞A570 nm值、GSH-Px和SOD活性最低，細(xì)胞內(nèi)ROS含量最高，與細(xì)胞對(duì)照組的差異顯著，表明本試驗(yàn)造模成功。

中藥多糖不但能提高機(jī)體的免疫功能，而且能抗氧化損傷，可作為自由基清除劑，抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激從而減少細(xì)胞核壞死細(xì)胞的數(shù)量[10-12]。VC能顯著提高動(dòng)物機(jī)體的生長(zhǎng)性能和抗氧化性能，提高ROS、GSH-Px和SOD活性，降低MDA含量，常被作為抗氧化陽性對(duì)照藥[13]。本試驗(yàn)采用先加多糖、然后用H2O2刺激，測(cè)定肝細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示，4個(gè)藥物組的細(xì)胞A570 nm值均高于H2O2組，LBP在1 000和500 μg·mL-1、AMP在1 000 μg·mL-1、CAP和VC在3個(gè)濃度組的細(xì)胞A570 nm值均顯著大于H2O2組，表明它們?cè)谶@些濃度能顯著抵抗H2O2引起的細(xì)胞活力降低。3個(gè)多糖相比，LBP組的細(xì)胞A570 nm值最高，抗氧化活性最強(qiáng)，接近陽性對(duì)照VC組。

3.2 多糖對(duì)雞胚肝細(xì)胞內(nèi)ROS含量的影響

活性氧簇(ROS)是在細(xì)胞有氧代謝中產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)活潑的氧自由基和能轉(zhuǎn)化為自由基的物質(zhì)，如羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧游離基等氧自由基和過氧化氫、氫過氧化物等非自由基[14]。ROS可氧化損傷DNA、蛋白質(zhì)等生物分子而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死[15-16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)藥物組的ROS含量多低于H2O2組，LBP和VC的3個(gè)濃度組、AMP和CAP在1 000和500 μg·mL-1組的ROS含量顯著低于H2O2組，表明它們?cè)谶@些濃度能顯著抑制H2O2引起的ROS升高。4個(gè)藥物組相比，LBP組的ROS含量最低，表明其抗氧化活性最強(qiáng)，明顯優(yōu)于陽性對(duì)照VC。

3.3 多糖對(duì)雞胚肝細(xì)胞內(nèi)GSH-Px和SOD活性的影響

抗氧化酶被認(rèn)為是防御細(xì)胞免受損害的一個(gè)主要的部分，組織中的抗氧化酶可以有效地清除異物代謝所產(chǎn)生的自由基[17]。GSH-Px和SOD作為自由基清除系統(tǒng)的抗氧化酶存在于所有氧代謝的細(xì)胞中，使細(xì)胞免受自由基損害，并為被氧化的細(xì)胞膜提供修復(fù)機(jī)制，已發(fā)現(xiàn)許多退化性疾病與機(jī)體的GSH-Px和SOD活性抑制相關(guān)聯(lián)。GSH-Px是一種重要的過氧化物分解酶，其功能主要是催化GSH參加過氧化反應(yīng)、清除機(jī)體代謝過程產(chǎn)生的過氧化物和羥自由基、保護(hù)細(xì)胞膜及結(jié)構(gòu)的完整性，SOD是機(jī)體內(nèi)清除氧自由基的重要抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基和保護(hù)細(xì)胞免受損傷，在維持機(jī)體的氧化和抗氧化平衡發(fā)揮重要作用[18-19]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，4個(gè)藥物組的GSH-Px和SOD活性均高于H2O2組，LBP和VC的3個(gè)濃度組、AMP和CAP在1 000和500 μg·mL-1組的GSH-Px活性顯著高于H2O2組；LBP、CAP和VC的3個(gè)濃度組、AMP在1 000和500 μg·mL-1組的SOD活性均顯著高于H2O2組；尤其它們?cè)诟?、中濃度組兩個(gè)酶的活性多顯著高于細(xì)胞對(duì)照組，表明三種多糖能夠抑制H2O2引起的抗氧化酶活性降低，而且能顯著提高抗氧化酶活性超過正常水平。3種 多糖中仍以LBP組兩個(gè)酶的活性值最高，抗氧化活性最強(qiáng)，與陽性對(duì)照VC組相當(dāng)。

4 結(jié) 論

LBP、AMP、CAP 3種多糖均有較強(qiáng)的抗氧化作用，能顯著抑制H2O2攻擊引起的雞胚肝細(xì)胞活力降低、細(xì)胞內(nèi)ROS升高、GSH-Px和SOD活性降低，并能顯著提高兩種抗氧化酶活性超過正常水平，從而保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化損傷。其中LBP的抗氧化作用最強(qiáng)，接近甚至優(yōu)于VC，可考慮作為多糖類抗氧化劑。