刁洪秀，李 藝，林德貴，張 迪

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京100193)

乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床最常見的腫瘤之一，在所有犬貓腫瘤性疾病中排名第二位，而犬乳腺腫瘤約占犬臨床腫瘤性疾病的50%[1]，嚴重威脅寵物的健康。腫瘤是一個及其復雜的生物學進程，多種原癌基因或抑癌基因的異常表達與乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。在人醫(yī)研究中發(fā)現(xiàn)，MUC1在腫瘤的侵襲過程中發(fā)揮關鍵作用[2]，并能激活MAPK、PI3K/AKT和Wnt信號通路[3]，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但在獸醫(yī)臨床上尚未見到相應的報道。本研究通過熒光定量PCR(real-time PCR)和免疫組織化學(IHC)檢測MUC1基因和MUC1在犬乳腺腫瘤中的表達情況，并分析其與腫瘤惡性分級的相關性，為犬乳腺腫瘤的診斷、治療和預后評估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣本

本試驗共檢測了47例犬乳腺腫瘤病例，年齡7～16歲(11.29±2.43)，所有病例均來自于2014年5月至2015年12月間來中國農業(yè)大學動物醫(yī)院就診的病例。無菌收集腫瘤組織，一部分迅速用液氮冷凍，隨后轉移至凍存管內于-80 ℃冰箱保存。另一部分于4%多聚甲醛固定后制備病理切片，并進行免疫組化染色。

1.2 主要試驗試劑

RNAgentsRTotal Isolation System 試劑盒(Promega公司)，real-time PCR試劑盒(SYBR?Premix DimerEraserTM)、Reverse Transcription PCR試劑盒(TaKaRa生物公司)，2×EasyTaqSuperMix(全式金生物技術有限公司)，MUC1單克隆抗體(Abcam)，SP-9002生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物公司)等。

1.3 RNA的提取和cDNA的合成

參照RNAgentsRTotal Isolation System 試劑盒說明提取樣本中的RNA，通過NanoDrop檢測RNA的濃度和純度，A260 nm/A280 nm的值在1.8～2.0，說明提取的RNA純度符合檢測要求。cDNA合成體系： RNA 1 μg、Oligo(dT) 1 μL、DEPC H2O 10 μL、5× PrimeScript Ⅱ Buffer 4 μL、dNTP Mixture(10 mmol·L-1)1 μL、RTase M-MLV(200 U·μL-1)0.5 μL、RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.5 μL，RNase Free dH2O補充至 20 μL。將上述混合物42 ℃ 延伸1 h，70 ℃ 保溫15 min 后終止反應，cDNA 保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MUC1基因的擴增

參照NCBI上已經發(fā)表的犬MUC1基因的mRNA序列(GenBank登錄號為AY703457)，利用Primer Premier5.0設計并合成一對特異性引物，上游引物：5′-GCCAACAAGGTGAAGACACAG-3′；下游引物：5′-CAGACTTGAACGGGGCAGA-3′，其目的產物片段長度為118 bp。

以“1.3”合成的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增體系：模板 2 μL、上游引物(10 μmol·L-1)1 μL、下游引物(10 μmol·L-1)1 μL、2×EasyTaqSuperMix 12.5 μL、去離子水補充至 25 μL，充分混勻。反應條件：94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸60 s，共34個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。

1.5 MUC1基因的real-time PCR檢測

通過比較CT法進行相對定量，選用的內參基因是β-actin。參照NCBI上已經發(fā)表的犬β-actin基因的mRNA序列(GenBank登錄號為NM001195845)，利用Primer Premier 5.0設計并合成一對特異性引物，上游引物：5′-ATATCGCTGCGCTTGTGGTC-3′；下游引物：5′-CCGTGCTCAATGGGGTACTTC-3′。

構建標準曲線，將cDNA進行梯度稀釋，得到5個梯度模板(100、10-1、10-2、10-3、10-4)進行real-time PCR檢測，根據模板拷貝數的對數和CT值繪制標準曲線。real-time PCR反應體系:模板1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物 0.5 μL、SYBR?Premix DimerEraserTM10 μL、ROX Reference DyeⅡ(50×) 0.4 μL，去離子水補充至 20 μL，充分混勻。real-time PCR反應程序：95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃數據采集1 s，共36個循環(huán)。60～90 ℃熔解曲線，0.3 ℃·s-1，60 ℃退火15 s，終止反應。

1.6 組織病理切片的制作

腫瘤組織經4%多聚甲醛固定過夜后，經過脫水、透化、浸蠟、包埋、切片等程序，切割成3 μm的石蠟切片。經HE染色中性樹膠封片后，于顯微鏡下觀察。

1.7 組織中MUC1的檢測

將“1.6”中的石蠟切片經脫水、抗原修復、封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色等過程進行IHC檢測。

IHC結果判讀：細胞結構中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒即存在MUC1蛋白的表達。對每個IHC樣本隨機選5個視野進行拍照，然后采用Image Pro Plus對照片平均光密度值(MOD)進行分析，陽性染色面積與目標蛋白的量成正比，染色的強度與目標蛋白的關系符合朗伯-比爾定律。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 腫瘤組織學鑒定

本試驗共收集乳腺腫瘤病例47例，參照2011年Goldschmidt等[4]提出的犬乳腺腫瘤的分類和分級標準進行組織學分類和惡性程度分級，詳見表1和表2。惡性腫瘤27例，良性腫瘤20例，組織惡性程度分級見表3。

表1組織惡性分級標準

Table1Criteriaforhistologicmalignantgrade

評分Score腺管形成Adenosine formation核多形性Nuclear pleomorphism高倍鏡視野下染色High power fields1分腺管形成良好輕度細胞核多形性和核染色每個視野下偶爾有核深染和有絲分裂相2分中等量腺管形成中度細胞核多形性和核染色每個視野下2-3個核深染或有絲分裂相3分少量或無腺管形成明顯細胞核多形性和核染色每個視野下多于3個核深染或有絲分裂相

表2乳腺腫瘤組織惡性分級

Table2Histologicmalignancygradeofmammaryneoplasms

總分Score惡性分級Malignancy grade3～5Ⅰ級(低度惡性),高分化6～7Ⅱ級(中度惡性),中度分化8～9Ⅲ級(高度惡性),低分化

表3乳腺腫瘤組織惡性程度分級

Table3MalignancygradeofMGTssamples

惡性程度分級Malignancy grade數量Number比例/%ProportionⅠ933.3Ⅱ1348.1Ⅲ510.4

2.2 MUC1基因表達

2.2.1MUC1和β-actin基因的擴增MUC1和β-actin基因PCR擴增得到如下瓊脂糖凝膠電泳成像結果：在100～200 bp之間以及200 bp水平出現(xiàn)清晰的單一條帶，與預測的MUC1和β-actin特異性引物擴增條帶大小相符(圖1)。

2.2.2 real-time PCR標準曲線 以Cycle為橫坐標，不同模板濃度的對數(log Quantity)為縱坐標繪制標準曲線，如圖2。相關系數(R2)均大于0.990，標準曲線可信度高，二者的擴增效率相近。

2.2.3 real-time PCR動力學曲線 對樣本中的mRNA轉錄所得cDNA進行real-time PCR試驗，生成的擴增曲線如圖3。

2.2.4 real-time PCR熔解曲線MUC1和β-actin熔解曲線均為單峰，產物特異性高，詳見圖4。

M.相對分子質量標準；1～3.β-actin；4～6.MUC1，均為惡性腫瘤樣品M. DNA marker; 1-3. β-actin; 4-6. MUC1, all samples were malignant mammary tumors圖1 MUC1和β-actin基因cDNA PCR擴增結果Fig.1 PCR products of cDNA by canine MUC1 and β-actin

2.2.5MUC1基因定量轉錄差異性分析 應用2-ΔΔCt對MUC1基因的轉錄進行定量分析，詳見圖5。在腫瘤組織(n=47)和正常組織(n=3)中MUC1基因相對轉錄量分別為12.50±4.95和1.55±0.64，二者之間存在統(tǒng)計學差異(P=0.01)。在不同的惡性分級中，MUC1基因相對轉錄量差異較大(圖6)。在Ⅰ級(n=9) 、Ⅱ級(n=13)和Ⅲ級(n=5)中相對轉錄量依次為2.25±1.48、1.75±1.41和30.24±11.24，Ⅲ級中MUC1基因相對轉錄量顯著高于Ⅰ級和Ⅱ級(P值分別是0.016和0.011)。

2.3 組織中MUC1的表達

乳腺腫瘤組織MUC1部分IHC結果見圖7，MUC1在正常乳腺組織細胞質內呈低表達，在乳腺腫瘤組織中細胞質和細胞核的著色，呈強陽性表達。經Image Pro Plus計算得出，正常組織(n=3)和腫瘤組織(n=47)的MOD分別為0.14±0.02和0.19±0.08，二者之間存在統(tǒng)計學差異(P=0.03)，詳見圖8。

圖2 real-time PCR標準曲線Fig.2 Standard curve of real-time PCR amplification

圖3 real-time PCR動力學擴增曲線Fig.3 Dynamic curve of real-time PCR amplification

圖4 real-time PCR熔解曲線Fig.4 Melting curve of real-time PCR amplification

*.P<0.05圖5 腫瘤組和正常組MUC1基因相對轉錄量Fig.5 Relative transcription of MUC1 in different groups

*. P<0.05圖6 不同惡性級別中MUC1基因相對轉錄量Fig.6 Relative transcription MUC1 in different malignance grades

惡性腫瘤組織(n=27)和良性腫瘤組織(n=20)的MOD分別為0.18±0.08和0.21±0.08，無統(tǒng)計學差異。在不同的惡性分級中MUC1表達有差異，Ⅰ級(n=9)的MOD顯著低于Ⅱ級(n=13)和Ⅲ級(n=5) 的MOD(P值分別為0.01和0.00)，見圖9。

a.正常乳腺組織；b、c、d.簡單癌組織a. Normal mammary tissue; b, c and d. Simple mammary cancer tissue圖7 MUC1在犬不同乳腺組織中的表達 400×Fig.7 Expression of MUC1 in canine mammary tumors 400×

*. P<0.05圖8 腫瘤組和正常組MUC1的MODFig.8 MOD of MUC1 in different groups

*. P<0.05圖9 不同惡性級別MUC1的MODFig.9 Expression of MUC1 in different malignance grades

3 討 論

MUC1 基因定位于染色體1q21，其表達的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[5]。在癌癥中，MUC1基因通過提高基因數量和轉錄水平，以及缺失轉錄后的調控來實現(xiàn)其過表達[2]。此外，MUC1在惡性腫瘤的侵襲和轉移中發(fā)揮重要作用。在自發(fā)性乳腺癌和胰腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，MUC1-/-小鼠腫瘤的侵襲和轉移要明顯遲于MUC1+/+的小鼠[6-7]。本研究中，MUC1在犬乳腺腫瘤組織相對表達量是正常乳腺組織的12.5倍，且在腫瘤的惡性分級中差異顯著，組織惡性程度越高，MUC1相對表達量越高，說明MUC1基因的異常表達同樣適用于犬乳腺腫瘤的診斷和預后評估。MUC1在正常上皮細胞表面呈極性分布，潤滑和保護底層上皮細胞免受干燥、pH值變化以及污染物和微生物的入侵[8]，在發(fā)生腫瘤時，MUC1糖基化異常會影響其在細胞表面的排列，并不斷向細胞內聚集，可能會增強致癌信號[9]。本試驗中MUC1在正常乳腺細胞頂部細胞質中呈低表達，而在乳腺腫瘤組織的細胞質和細胞核內均呈現(xiàn)強陽性表達，與前人研究相一致。有研究顯示，MUC1脫落的胞外結構域(MUC1-N)可作為癌癥分級和治療評估的生物標志物[10]，且與預后不良呈明顯的相關性[11]。本試驗中對MUC1的IHC檢測發(fā)現(xiàn)，MUC1的MOD值隨著腫瘤惡性程度的增強而增加，提示MUC1在犬乳腺腫瘤組織中的表達與組織惡性程度分級有關。

4 結 論

MUC1基因和MUC1在犬乳腺腫瘤組織中高表達，且與組織惡性程度分級密切相關，可為犬乳腺腫瘤診斷和惡性程度評估提供參考，為犬乳腺腫瘤的臨床治療提供理論數據。