郭海勇，袁洪興，孫泰然，曹 靜，宋勤葉*，李潭清，逯紀(jì)成

(1.吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四平 136000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 河北省獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，保定 071001； 3.河北省保定市動物疫病預(yù)防控制中心，保定 071000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎兒、不孕等繁殖障礙，哺乳仔豬呼吸系統(tǒng)疾病、大量死亡，生長豬呼吸道疾病頻發(fā)、成活率降低的重要傳染病，嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展[1-4]。PRRS于1987年首次在北美暴發(fā)流行[5]，1996年我國首次報道此病并分離到病毒[6]，2006年由PRRSV變異株引起的高致病性PRRSV(highly pathogenic PRRSV, HP-PRRSV)在國內(nèi)各地豬場廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[1,7]。

PRRSV主要感染宿主的單核/巨噬細(xì)胞，損害機體免疫功能，引起Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和IFN-γ的表達(dá)水平下降[8-12]。此外，PRRSV雖然在感染早期可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，但是該抗體無抑制或中和病毒作用，而直到感染4周后才能夠檢測到高親和力的病毒中和抗體[2,13]。PRRSV感染引起的免疫功能抑制和低水平中和抗體導(dǎo)致病毒在宿主體內(nèi)持續(xù)性存在，出現(xiàn)抗體依賴性增強作用(antibody-dependent enhancement, ADE)感染免疫特征[2-4,13-14]。轉(zhuǎn)移因子(transfer factor，TF)于1954年首次發(fā)現(xiàn)和報道，是具有免疫活性的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一類可透析的小分子物質(zhì)，其相對分子質(zhì)量<5 ku，是由核酸和多肽相連而成的雜合分子[15-16]。TF能特異性地將供體的細(xì)胞免疫功能轉(zhuǎn)移給受體，具有激發(fā)免疫細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強機體特異性和非特異性細(xì)胞免疫功能等作用，并且無熱原和抗原性，不引起過敏反應(yīng)，無明顯毒副作用和種屬特異性，其對于惡性腫瘤性疾病、免疫缺陷性疾病以及病毒、細(xì)菌和寄生蟲等引起的感染性疾病具有良好輔助治療和預(yù)防效果[15-18]。李士學(xué)等[19]從PRRSV滅活疫苗免疫豬和非免疫豬的脾分別提取了TF，發(fā)現(xiàn)從免疫豬提取的TF對小鼠外周血淋巴細(xì)胞(peripheral blood lymphocyte，PBLC)轉(zhuǎn)化能力的增強作用更高。但該研究未報道所制備轉(zhuǎn)移因子的成分，也未對豬免疫細(xì)胞的增強作用進(jìn)行深入研究。PRRSV侵害機體免疫細(xì)胞，引起機體免疫功能抑制，且目前PRRSV疫苗免疫效果不理想，研發(fā)能夠改善機體免疫力和增強疫苗免疫效果的免疫增強劑具有現(xiàn)實意義。TF可以調(diào)節(jié)和改善機體細(xì)胞免疫功能，是一種應(yīng)用前景廣闊的免疫調(diào)節(jié)劑。本研究從PRRSV弱毒活疫苗免疫豬的脾中提取TF，分析其成分及免疫活性，旨在為改善PRRSV疫苗的免疫效果和新型免疫增強劑的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 疫苗與主要試劑

PRRSV弱毒活疫苗，購自吉林省元亨生物技術(shù)有限公司；淋巴細(xì)胞分離液(密度為1.077 g·mL-1)，購自北京Solarbio公司；無酚紅RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)液、噻唑藍(lán)(MTT)及 ConA，均為美國Promega 公司產(chǎn)品。PRRSV抗體檢測試劑盒，為美國IDEXX公司產(chǎn)品。

1.2 動物

4周齡和3月齡健康非免疫豬(杜洛克×長白× 大約克夏三元雜交)，購自河北保定某規(guī)模化豬場。6～8周齡SPF BALB/c小鼠，購自河北醫(yī)科大學(xué)。

1.3 TF的制備

給2頭3月齡豬肌內(nèi)注射PRRSV弱毒疫苗，以每頭豬3頭份劑量連續(xù)接種4次；第4次免疫10 d 后，采取前腔靜脈血，分離血清；按照ELISA檢測試劑盒說明，檢測PRRSV抗體。當(dāng)特異抗體水平合格(S/N值在1.5左右)，用2.5%戊巴比妥鈉麻醉后，無菌采取豬的脾，去除被膜和結(jié)締組織，用無菌生理鹽水沖洗3次，稱重，剪碎；加入適量無菌生理鹽水，制成勻漿；經(jīng)凍融—透析后，收集透析外液，過濾除菌后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 理化性質(zhì)及主要成分檢測

觀察TF的顏色及有無沉淀物產(chǎn)生，嗅其氣味，測定pH值。應(yīng)用磺基水楊酸法，檢測TF中是否含有蛋白質(zhì)；通過茚三酮反應(yīng)和硝酸—鉬酸銨試驗，分別檢測TF中的氨基酸和核酸成分；用紫外分光光度計測量波長為260 nm和280 nm的光密度吸收(OD)值，計算OD260 nm/OD280 nm值，當(dāng)OD260 nm/OD280 nm>2.0時，表示制備的TF合格。

1.5 氨基酸種類及含量的測定

取1 mL樣品加入9 mL 6.0 mol·L-1的鹽酸，110 ℃下水解14 h，冷卻至室溫；取水解液5 mL真空抽干，加入0.1 mol·L-1的鹽酸1.0 mL溶解后，經(jīng)過氨基酸衍生，用高效液相色譜儀(Agilent 1200)檢測TF中的氨基酸組成及其含量。

1.6 免疫活性檢測

1.6.1 巨噬細(xì)胞吞噬率的檢測 取BALB/c小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組6只。試驗組每只小鼠腹腔注射1 mL TF；對照組每只小鼠腹腔注射等體積的生理鹽水。每隔24 h注射一次，連續(xù)注射5次。參照文獻(xiàn)[20]所述方法，采取腹腔液，滴于載玻片上，經(jīng)姬姆薩染色后，顯微鏡下計數(shù)吞噬紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)，計算吞噬率。吞噬率(%)=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個巨噬細(xì)胞×100%。

1.6.2 小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗 采集3只6～8 周齡BALB/c小鼠眼球血，分離PBLC，用適量含10%小牛血清無酚紅的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮。經(jīng)1%臺盼藍(lán)染色，顯微鏡下檢測PBLC的活性>95%時，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個·mL-1；將100 μL細(xì)胞懸液加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的相應(yīng)各孔內(nèi)，每個樣品重復(fù)3孔，每孔用2.78 μg TF刺激，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。同時設(shè)立ConA(終濃度為10 μg·孔-1)陽性和生理鹽水陰性對照孔。每孔加入10 μL MTT溶液(5 μg·μL-1)， 混勻，于37 ℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)4 h；每孔加入100 μL 10% SDS-0.01 mol·L-1鹽酸，混勻后于37 ℃作用30 min；消除孔內(nèi)氣泡，測定OD570 nm光密度值，計算各組淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)(stimulating index，SI)。SI=(刺激孔OD值-營養(yǎng)液對照孔的OD值)/(不刺激的陰性對照孔的OD值-營養(yǎng)液對照孔的OD值)。

1.6.3 PRRSV弱毒疫苗-TF免疫豬外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗 將4 周齡健康仔豬隨機分為A、B、C組，每組3頭。A組：每頭豬左、右側(cè)耳后分別肌內(nèi)注射1頭份PRRSV弱毒疫苗和1 mL TF；B組：每頭豬注射1頭份PRRSV弱毒疫苗和1 mL TF的混合液；C組：每頭豬注射1頭份PRRSV弱毒疫苗和1 mL生理鹽水混合液。免疫前0 d和免疫后20 d ，經(jīng)前腔靜脈采血，分離外周血淋巴細(xì)胞，應(yīng)用MTT法檢測淋巴細(xì)胞增殖活性。MTT試驗方法及SI的計算方法同“1.6.2”。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用 SPSS 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，用成對樣本T-test方法檢驗不同組的吞噬細(xì)胞吞噬率以及小鼠外周血淋巴細(xì)胞SI的差異，用Two-way ANOVA方法檢驗不同組的豬外周血淋巴細(xì)胞SI的差異。當(dāng)P<0. 05 時，差異顯著；P<0. 01 時，差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 理化性質(zhì)及主要成分

制備的TF呈淡黃色的澄清液體，有微弱的腥味，pH值為6.44；與20%磺基水楊酸反應(yīng)無沉淀生成，與茚三酮反應(yīng)溶液呈藍(lán)紫色，說明TF溶液中無蛋白質(zhì)成分，但含有氨基酸；與硝酸-鉬酸銨反應(yīng)有黃色沉淀生成，生理鹽水對照無沉淀生成，表明TF溶液內(nèi)含有PO43-。紫外分光光度計測定的OD260 nm和OD280 nm的平均值分別為0.430和0.155，OD260 nm/OD280 nm值為2.77，核酸的含量為21.5 μg·mL-1。

2.2 氨基酸種類及其含量

經(jīng)高效液相色譜儀分析可知，制備的TF含有18種氨基酸(圖1和表1)。其中谷氨酸的含量最高，為0.642 mg·mL-1，其次為非蛋白氨基酸——?；撬?，含量為0.298 mg·mL-1，此后依次為甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸等，每毫升TF中含氨基酸總量為3.479 mg。

圖1 TF氨基酸組成的高效液相色譜分析Fig.1 The amino acid composition analysis of TF by high performance liquid chromatography

2.3 TF可以增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性

顯微鏡下計數(shù)200個細(xì)胞，計算腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞吞噬率。注射TF組的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞的吞噬率為54.48%，注射生理鹽水對照組的吞噬率為39.73%，兩組間差異極顯著(P<0.01) (圖2)，表明TF能顯著增強小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性。

2.4 TF能夠提高小鼠PBLC的增殖能力

用制備的TF和ConA分別刺激小鼠PBLC 48 h后，通過MTT法檢測各組淋巴細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)TF和ConA刺激組的PBLC增殖的SI均顯著高于陰性對照組的SI (P<0.05)，并且TF刺激細(xì)胞的增殖活性顯著高于ConA刺激細(xì)胞(P<0.05)(圖3)。該結(jié)果表明TF能夠顯著提高PBLC的增殖活性(圖3)。

2.5 TF改善了PRRSV疫苗免疫豬PBLC的增殖活性

用PRRSV弱毒疫苗-TF免疫仔豬后20 d，通過MTT法檢測PBLC的增殖活性。同時在不同部位注射PRRSV弱毒疫苗和TF組(A組)及接種PRRSV弱毒疫苗與PRRSV-TF混合液組(B組)的PBLC刺激指數(shù)分別為2.83±0.32和2.95±0.38，均顯著高于單獨接種PRRSV弱毒疫苗組(C組)的SI(1.29±0.31)(P<0.01)，但A組和B組間沒有顯著差異(圖4)。結(jié)果表明，TF與PRRSV弱毒疫苗同時分別接種，或者TF與PRRSV弱毒疫苗混合注射，均能夠顯著改善豬的細(xì)胞免疫功能。

表1TF中氨基酸的種類及其含量

Table1KindsandcontentsofaminoacidsintheTF

氨基酸類別Kinds of amino acids含量/(mg·mL-1)Contents 天冬氨酸 Asp0.246谷氨酸 Glu0.642組氨酸 His0.065絲氨酸 Ser0.251精氨酸 Arg0.194甘氨酸 Gly0.274蘇氨酸 Thr0.144脯氨酸 Pro0.253丙氨酸 Ala0.195纈氨酸 Val0.152甲硫氨酸 Met0.061半胱氨酸 Cys0.070異亮氨酸 Ile0.129亮氨酸 Leu0.212苯丙氨酸 Phe0.119賴氨酸 Lys0.086酪氨酸 Tyr0.087牛磺酸 Tau0.298

**. P<0. 01，兩組間差異極顯著**. P<0. 01, mean significant differences between two groups圖2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬活性Fig.2 Phagocytic activity of mice celiac macrophagocytes

*. P<0.05，兩組間差異顯著*. P<0.05, mean significant differences between two groups圖3 小鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖活性Fig.3 Proliferation activities of mice PBLC

A. PRRSV疫苗與TF分開注射；B. PRRSV疫苗與TF混合液注射；C. PRRSV疫苗單獨免疫。**. P<0. 01，兩組間差異極顯著A. Injecting PRRSV vaccine and TF separately; B. Injecting the mixture of PRRSV vaccine and TF; C. Injecting PRRSV vaccine only. **. P<0. 01, mean significant differences between two groups圖4 免疫豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性Fig.4 Proliferation activities of PBLC from immunized pigs

3 討 論

PRRSV不僅可以引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬死亡，而且還可導(dǎo)致豬非特異性和特異性免疫功能抑制，致使PRRSV感染豬與其他病原混合感染及免疫失敗現(xiàn)象屢屢發(fā)生[21-23]。因此，研究和開發(fā)改善豬免疫功能和提高疫苗免疫效果的免疫增強制劑具有重要意義。轉(zhuǎn)移因子因具備傳遞免疫信息、調(diào)節(jié)和增強機體免疫功能等優(yōu)勢，已經(jīng)被廣泛用于腫瘤、傳染病、寄生蟲病、過敏和自身免疫性疾病的防治研究與實踐中[16,19,24-25]。用某種抗原免疫人或動物制備的TF對相應(yīng)疾病的治療效果更好[19,26]，目前臨床上用于治療乙型肝炎病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、艾滋病病毒和寄生蟲等疫病及腫瘤的轉(zhuǎn)移因子多是從用特異抗原免疫機體提取的TF[16]。本研究從PRRSV弱毒活疫苗強化免疫豬的脾內(nèi)提取了TF，該TF由核酸和至少18種氨基酸組成，比孔慶波等[27]從豬脾提取的TF多了一種?；撬幔f明從不同免疫原免疫動物組織提取的轉(zhuǎn)移因子的組成成分可能不完全一致。值得注意的是，?；撬釣榉堑鞍装被?，不參與蛋白的生物合成，但與胱氨酸、半胱氨酸的代謝密切相關(guān)，具有維持正常生殖功能，提高機體免疫力等生物學(xué)功能。而且本研究中制備的TF中?；撬岬暮績H次于含量最高的谷氨酸，推測其很可能在調(diào)節(jié)PRRSV感染機體免疫功能與改善免疫效果方面發(fā)揮著較重要的作用。

巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等單核/巨噬細(xì)胞系是PRRSV的靶細(xì)胞。PRRSV能夠在豬肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，抑制細(xì)胞的吞噬功能以及Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和IFN-γ的表達(dá)，同時PRRSV感染引起淋巴細(xì)胞總數(shù)降低、CD4+與CD8+T細(xì)胞總數(shù)的比值下降，致使機體免疫功能抑制或紊亂，不能及時清除體內(nèi)病毒[2,4,22,28-29]。本試驗發(fā)現(xiàn)從PRRS弱毒活疫苗免疫豬的脾中提取的TF能夠顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，說明其可以改善巨噬細(xì)胞的免疫功能。該TF是否會影響宿主Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和IFN-γ的表達(dá)以及CD4+與CD8+T細(xì)胞總數(shù)的比值，將進(jìn)一步通過動物試驗加以驗證。

PRRSV感染豬4～6周后，才可以檢測到高親和力的特異性中和抗體IgG，而此前病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體不能中和體內(nèi)病毒，并且還發(fā)現(xiàn)即使在中和抗體存在的條件下，PRRS病毒血癥可以持續(xù)存在[30-32]。這些現(xiàn)象提示在機體抗PRRSV感染免疫中，細(xì)胞免疫可能發(fā)揮著重要作用。因此，提高細(xì)胞免疫功能對于控制病毒感染具有重要作用。本研究中，TF能夠同時顯著增強小鼠和PRRSV弱毒疫苗免疫豬外周血淋巴細(xì)胞的增殖活性，但對免疫豬的特異抗體水平?jīng)]有明顯提高作用(數(shù)據(jù)未在本文顯示)，表明制備的TF主要改善細(xì)胞免疫功能，與文獻(xiàn)報道的轉(zhuǎn)移因子主要表現(xiàn)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性相同[16,24,26]。從PRRSV弱毒活疫苗免疫豬脾中提取的TF具有提高細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)活性，可能有助于機體對PRRSV的清除，縮短病毒血癥的持續(xù)時間。同時提示該TF與疫苗的聯(lián)合應(yīng)用對阻止或降低免疫機體被野毒感染具有重要意義。

4 結(jié) 論

從豬繁殖與呼吸綜合征弱毒活疫苗免疫豬的脾中提取了轉(zhuǎn)移因子，其含有核酸和18種氨基酸，不含蛋白質(zhì)。該轉(zhuǎn)移因子能顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬功能和小鼠外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力，改善PRRSV疫苗免疫豬的細(xì)胞免疫功能。