朱建波，楊振興，肖 雷，高 林，苗海生，何于雯，孟錦昕，楊 恒，李華春

(云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室， 昆明 650224)

流行性出血病(epizootic haemorrhagic disease，EHD)是通過節(jié)肢昆蟲庫蠓傳播流行性出血病病毒(EHDV)，引起的一種非接觸傳染病[1]。該病能感染野生及家養(yǎng)反芻動物，特別是引起白尾鹿體溫升高、黏膜和漿膜面廣泛出血，并常于昏迷狀態(tài)下死亡[2]。牛感染發(fā)病，癥狀主要是發(fā)熱、厭食、潰瘍性口炎、呼吸疾病、一些組織器官特別是舌的出血壞死，茨城病由EHDV-2病毒型感染引起，可致牛消瘦、脫水，最后因肺炎而死[3]。部分羊也能感染發(fā)病，癥狀主要表現(xiàn)為皮下水腫，心外膜、眼結(jié)膜和瘤胃及腸的漿膜表面出血，胸部和心包囊有黃色液體，鼻排帶綠色黏質(zhì)物[4]。此病在流行期危害較大，嚴重影響著畜牧業(yè)和國際貿(mào)易的發(fā)展，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)已將EHD列為法定報告?zhèn)魅静5]。

近年來，云南、新疆、內(nèi)蒙古、廣西和廣東等地進行的血清學(xué)調(diào)查均檢出EHDV陽性血清，特別是存在對牛有較強致病力的EHDV-2、6和7型[6-9]。2015年曹穎穎等[10]在廣西分離到EHDV-5型毒株，2016年呂敏娜等[11]在廣東分離到EHDV-1型毒株，本實驗室自2012年至2017年間在云南牛體內(nèi)分離到多株EHDV-1、2、5、6和7型毒株。以上結(jié)果表明EHDV在我國分布廣泛，存在發(fā)生該病的風(fēng)險，因此該病的血清學(xué)檢測方法研究對我國進出口貿(mào)易及疫病防控具有重要意義。

目前，有學(xué)者用表達的EHDV VP7蛋白作包被抗原建立檢測抗體的間接ELISA方法，或用EHDV群特異性單克隆抗體建立了C-ELISA檢測方法，但均無商品化試劑盒[12-14]。本實驗室曾制備多株EHDV單克隆抗體，由于均未達到診斷檢測要求，無法用于組裝高質(zhì)量C-ELISA試劑盒。所以本研究選擇用純化滅活后的EHDV-6型病毒作為ELISA檢測用標準抗原，豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗體作為競爭抗體與待檢抗體競爭，通過抑制率大小來判斷待檢血清陰陽性，建立了檢測EHDV抗體的C-ELISA方法。該方法具有較好的特異性和敏感度，同時具有快速診斷、使用方便等優(yōu)點，為EHDV血清抗體普查提供了一種有效工具。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

高吸附ELISA板購自COSTAR公司，抗原保護劑購自CANDOR公司，羊抗豚鼠HRP標記二抗購自Abcam公司，TMB購自SurModics公司，脫脂奶粉購自BD difco公司，BCA Protein Assay Kit購自TaKaRa公司，二乙烯亞胺(BEI)、佐劑206由云南省保山疫苗廠提供，0.01 mol·L-1PBS中加入0.05%的Tween-20配制成PBST洗液，PBST中加入1%的脫脂奶粉配制成稀釋液。

1.2 毒株、實驗動物、血清及細胞

EHDV-2、6型毒株由本實驗室從2012年云南師宗牛血中分離獲得，經(jīng)病毒中和試驗和基因序列分析鑒定定型。5月齡豚鼠購自云南省昆明醫(yī)科大學(xué)動物試驗中心，健康無疾病，檢驗合格；黃牛和山羊購自云南牲畜交易市場，6月齡，健康無病，經(jīng)核酸RT-PCR及血清中和試驗檢測，證明未感染過EHDV。不同血清型EHDV陽性血清及陰性血清，藍舌病病毒(BTV)、山羊痘病毒(GPV)、中山病病毒(CHUV)和赤羽病病毒(AKAV)陽性血清，由本實驗室保存；小反芻獸疫病毒(PPRV)陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈；口蹄疫病毒(FMDV)、牛流行熱病毒(BEFV)陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所惠贈；BHK-21細胞由本實驗室保存。

1.3 病毒純化及抗血清制備

采用長成單層的BHK-21細胞培養(yǎng)EHDV-2、6型毒株，7 d出現(xiàn)100%細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)后收獲病毒，冰水浴下超聲波破碎處理3次，將上層液體置于30%～70%的蔗糖連續(xù)密度梯度上進行密度梯度離心，8 ℃ 35 000 r·min-1離心4 h，在40%～60%結(jié)合處獲得純化的病毒帶，37 ℃ 1.5 mmol·L-1BEI滅活處理12 h，6型病毒作為包被抗原，2型病毒經(jīng)佐劑206乳化，按每只免疫0.5 mL，免疫4只豚鼠，21 d后加強免疫1次，每次免疫7 d后采血分離血清，進行血清中和試驗測定抗體效價。

1.4 最佳抗原包被濃度和競爭抗體濃度的確定

用棋盤法篩選最佳抗原包被濃度和最佳競爭抗體使用濃度。將純化滅活后的6型EHDV抗原用包被液按1∶4 000～1∶14 000倍稀釋，50 μL·孔-14 ℃ 過夜包被反應(yīng)板；PBST洗滌后用5%的馬血清37 ℃封閉 2 h；拍干馬血清，每孔各加入10 μL的陰性(N)和陽性(P)血清后，加入用稀釋液按同樣稀釋倍數(shù)配制好的豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗體(競爭抗體)50 μL·孔-137 ℃ 30 min；拍干液體后加入HRP酶標抗體50 μL·孔-137 ℃ 30 min；PBST洗板6次，加入TMB 50 μL·孔-1，避光顯色12 min；每孔加入50 μL 1.5 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng)，測定OD450 nm值，比較陰陽性對照OD450 nm值(N/P值)，N/P值最大的反應(yīng)孔中使用的包被濃度和競爭抗體濃度即為最佳濃度。

1.5 臨界值的確定

對270份(180份牛血清和90份羊血清)陰性血清進行C-ELISA檢測，對所有的抑制率進行統(tǒng)計分析，計算樣本的平均抑制率和標準偏差(s)。根據(jù)公式：臨界值=陰性樣品平均抑制率+3×s[15]，計算出臨界值。對270份(250份牛血清和20份羊血清)陽性血清進行C-ELISA檢測，確定最小陽性血清抑制率(present inhabitation，PI)，PI=(陰性對照OD-樣品OD)/陰性對照OD[16]。綜合陰性和陽性血清的檢測結(jié)果，確定試劑盒的判定標準。

1.6 特異性試驗

對各1份EHDV(1、2、5、6、7和8型)和BTV(1～24 型)陽性血清，各2份GPV、AKAV、CHUV、PPRV、FMDV、BEFV陽性血清進行檢測，確定檢測方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將已知血清中和抗體效價的各1份EHDV(1、2、5、6、7和8型)陽性血清從1∶10倍開始進行倍比稀釋，同時進行血清中和試驗(SNT)、瓊脂擴散試驗(AGID)和C-ELISA檢測，比較三種方法檢出陽性的血清最大稀釋度，驗證試劑盒的敏感性。

1.8 臨床樣品測定試驗

2014—2017年間，每年挑選10頭牛和5頭山羊作為監(jiān)控動物，經(jīng)核酸及SNT檢測，證明未感染過EHDV，放養(yǎng)在云南師宗農(nóng)戶家中組成監(jiān)控群。每年4月至11月每周采集一次血清和抗凝血，11月 至次年3月每月采集一次，次年4月更換監(jiān)控動物，分別用C-ELISA、SNT檢測血清，RT-PCR和病毒分離試驗檢測抗凝血，比較這4種方法的符合情況。

1.9 重復(fù)性試驗

從同一批次(WH603-1W)及不同批次(WH603-2W、WH603-3W、WH603-4W和WH603-5W)C-ELISA 試劑盒中隨機取4個，分別檢測4份陽性樣品和4份陰性樣品，并設(shè)陽性對照和陰性對照，每份樣本重復(fù)2孔，計算PI值的變異系數(shù)，以檢驗批次內(nèi)及批次間重復(fù)性。

1.10 再現(xiàn)性試驗

將各4份的陽性、弱陽性和陰性血清分成3管，各取2管同2個試劑盒、結(jié)果統(tǒng)計表和操作說明，分別采用冷鏈運輸(環(huán)境溫度控制在4～8 ℃)送至新疆畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所(Lab 1)、山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病學(xué)實驗室(Lab 2)，2 d內(nèi)到達。剩下1管 血清留在本實驗室，即云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室(Lab 3)進行檢測。每個實驗室收到樣品，2 d內(nèi)開始檢測，設(shè)置三個重復(fù)。完成后將檢測結(jié)果報至本實驗室，進行再現(xiàn)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 病毒純化及抗體制備

用PBS將純化滅活后的2型EHDV稀釋250倍，BAC法測定總蛋白質(zhì)量濃度為192 μg·mL-1，佐劑乳化后免疫豚鼠，每次免疫后取血測定血清中和抗體效價(表1)，1號和3號豚鼠在試驗過程中死亡，2號和4號豚鼠3次免疫后血清中和抗體效價為1∶2 560和1∶1 810，選取2號豚鼠高免血清作為競爭抗體使用。

2.2 最佳抗原包被濃度和最佳競爭抗體濃度的確定

棋盤法滴定結(jié)果顯示6型EHDV抗原按1∶10 000 倍稀釋(總蛋白質(zhì)量濃度為5.12 μg·mL-1)，競爭抗體按1∶10 000倍稀釋時，陰性對照(N)OD450 nm為1.04，接近1.0；陽性對照(P)OD450 nm為0.074，背景較低；陰陽反差N/P值14.05，最大，因此在C-ELISA體系中抗原1∶10 000稀釋包被反應(yīng)板，競爭抗體最佳工作濃度為稀釋1∶10 000倍(表2)。

2.3 臨界值的確定

對270份牛、羊陰性血清進行C-ELISA檢測，平均PI值為4.88%，標準差(s)為0.133，根據(jù)公式：臨界值=陰性樣品平均抑制率+3×s，計算出臨界值為44.78%；對同樣數(shù)量的陽性血清進行檢測 并計算PI值，最小PI為45.87%，平均PI為76.00%，對以上結(jié)果進行統(tǒng)計(圖1)。PI在40%～50%間為在一個過渡區(qū)域，極少數(shù)陰性和弱陽性血清樣品存在此期間內(nèi)，為保證檢測的準確性，將臨界值設(shè)定為50%，PI>50%判定為陽性，PI在40%～50%之間判定為可疑。

表1豚鼠血清中和抗體效價

Table1Neutralizingantibodytiterofguineapigserum

動物編號Animals No.抗體效價 Antibody titer0次免疫Non immune1次免疫Primary immune2次免疫Secondary immune3次免疫Tertiary immune101∶1131∶453死亡Die201∶571∶6401∶2 560301∶80死亡Die-401∶1601∶1 2801∶1 810

表2包被抗原及競爭抗體最佳濃度的確定

Table2DeterminationofoptimalconditionsofthecompetitiveELISA

包被抗原稀釋度Antigen dilution指標Indexes豚鼠抗EHDV抗體稀釋度Guinea pig anti-EHDV antibody dilution1∶4 0001∶6 0001∶8 0001∶10 0001∶12 0001∶14 0001∶4 000OD450 nmN1.831.701.541.431.251.18OD450 nmP0.1890.1750.1640.1510.1370.108N/P9.689.719.399.479.1210.93 1∶6 000OD450 nmN1.721.591.481.291.201.11OD450 nmP0.1790.170.1580.1420.1170.091N/P9.619.359.379.0810.2612.20 1∶8 000OD450 nmN1.561.431.241.161.010.82OD450 nmP0.1680.1520.1380.1140.0830.077N/P9.299.418.9910.1812.1710.65 1∶10 000OD450 nmN1.431.241.121.040.890.76OD450 nmP0.1520.1310.1030.0740.0690.068N/P9.419.4710.8714.0512.9011.18 1∶12 000OD450 nmN1.261.111.020.870.780.69OD450 nmP0.1390.1160.0880.0710.0680.065N/P9.069.5711.5912.2511.4710.62 1∶14 000OD450 nmN1.151.030.890.750.690.48OD450 nmP0.1130.0940.0760.0690.0650.064N/P10.1810.9611.7110.8710.627.50

2.4 特異性試驗

對各1份的不同血清型EHDV和BTV陽性血清，各2份GPV、AKAV、CHUV、PPRV、FMDV、BEFV陽性血清進行C-ELISA檢測(表3)。結(jié)果表明不同血清型EHDV血清檢測均為陽性，24種血清型BTV陽性血清及其他相關(guān)病毒陽性血清檢測結(jié)果均為陰性。因此，該ELISA方法具有較好的群特異性，與其他牛、羊易感病毒的陽性血清無交叉反應(yīng)。

圖1 270份陰性血清和270份陽性血清C-ELISA PI值頻率分布圖Fig.1 Distribution of the EHDV C-ELISA results of 270 negative sera and 270 positive sera

2.5 敏感性試驗

將中和抗體效價為1∶113、1∶160、1∶320、1∶320、1∶226和1∶453的6種不同血清型EHDV血清，從1∶10開始倍比稀釋，同時進行C-ELISA、SNT和AGID檢測(表4)。C-ELISA能檢測出陽性的血清最大稀釋度分別為1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶1 280、1∶640和1∶1 280，均高于SNT和AGID；AGID能檢出陽性的血清稀釋度最小，超過1∶80倍，檢測結(jié)果均為陰性。

表3EHDVC-ELISA特異性試驗檢測結(jié)果

Table3ThespecificityassayofEHDVC-ELISA

血清Sera抗體效價Titer抑制率/%PI判定結(jié)果Result血清Sera抗體效價Titer抑制率/%PI判定結(jié)果ResultEHDV-11∶16086.72+BTV-161∶32013.10-EHDV-21∶16085.60+BTV-171∶1131.70-EHDV-51∶32091.50+BTV-181∶4011.75-EHDV-61∶16087.50+BTV-191∶4010.70-EHDV-71∶32089.90+BTV-201∶579.83-EHDV-81∶32089.40+BTV-211∶8021.40-BTV-11∶2822.50-BTV-221∶1131.33-BTV-21∶576.40-BTV-231∶4012.41-BTV-31∶4021.10-BTV-241∶5713.50-BTV-41∶8015.20-GPV No. 1Positive4.31-BTV-51∶5712.30-GPV No. 2Positive5.20-BTV-61∶1135.80-AKAV No. 11∶403.10-BTV-71∶1600.30-AKAV No. 21∶571.70-BTV-81∶3200.40-CHUV No. 11∶5711.75-BTV-91∶4023.50-CHUV No. 21∶8010.70-BTV-101∶5720.95-PPRV No. 11∶809.83-BTV-111∶22620.70-PPRV No. 21∶5713.10-BTV-121∶11323.00-FMDV No. 11∶641.70-BTV-131∶570.28-FMDV No. 21∶1281.75-BTV-141∶8021.30-BEFV No. 11∶11310.70-BTV-151∶16023.00-BEFV No. 21∶809.83-

+．陽性；-．陰性

+．Positive；-．Negative

表4C-ELISA、SNT和AGID檢測敏感度的比較

Table4ThecomparisonofsensitiveofC-ELISA,SNTandAGID

血清型Serotype抗體效價Titer檢測方法Methods不同血清稀釋度的檢測結(jié)果a Detection results of different serum dilution a1∶101∶201∶401∶801∶1601∶3201∶6401∶1 2801∶2 560EHDV-11∶113C-ELISA(PI/%)83.1279.4575.1670.6565.0359.1143.0734.7227.73SNT++++-----AGID+++------EHDV-21∶160C-ELISA(PI/%)88.0185.4580.3277.1274.9268.0357.2143.3234.95SNT+++++----AGID+++------EHDV-51∶320C-ELISA(PI/%)90.8786.8181.0680.6076.5369.0262.8154.0439.73SNT++++++---AGID++++-----EHDV-61∶320C-ELISA(PI/%)91.7088.3083.4080.7075.5066.3061.3053.2636.40SNT++++++---AGID++++-----EHDV-71∶226C-ELISA(PI/%)89.2185.3580.9779.6973.3263.1158.2847.1426.37SNT+++++----AGID+++------EHDV-81∶453C-ELISA(PI/%)91.9688.7084.4481.6079.3475.6765.5954.3530.67SNT++++++---AGID++++-----

a. 檢測結(jié)果：C-ELISA以“PI/%”表示；SNT、AGID 以“陰、陽性”表示(+．陽性；-．陰性)

a. Detection results: C-ELISA results are displayed withPI(%); SNT, AGID results are displayed with positive or negative (+．Positive；-．Negative)

2.6 臨床樣品測定

2014—2017年間，共對40頭牛和20頭羊采集的各1 980份血清和抗凝血進行C-ELISA、RT-PCR及病毒分離檢測。C-ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，2014年6、7月3頭牛轉(zhuǎn)陽，轉(zhuǎn)陽率為30%；2015年8月1頭牛轉(zhuǎn)陽，轉(zhuǎn)陽率為10%；2016年10月2頭牛轉(zhuǎn)陽，轉(zhuǎn)陽率為20%；2017年6月2頭牛轉(zhuǎn)陽，轉(zhuǎn)陽率為20%，除2016年動物在10月轉(zhuǎn)陽，其余動物均在6—8月轉(zhuǎn)陽，說明夏季蟲媒活動更頻繁，易引起蟲媒病傳播。4年間均未發(fā)現(xiàn)山羊血清轉(zhuǎn)陽，動物血清轉(zhuǎn)陽前后幾周試驗數(shù)據(jù)見表5。測定分離病毒TICD50后，用病毒同對應(yīng)牛的血清進行SNT，血清轉(zhuǎn)陽結(jié)果同C-ELISA結(jié)果吻合；抗凝血RT-PCR檢測及病毒分離證明血清轉(zhuǎn)陽動物均被EHDV感染，感染時間和血清轉(zhuǎn)陽時間吻合；其他動物樣品4種方法連續(xù)檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法能準確檢測出動物的血清轉(zhuǎn)陽，有很好的準確性。

2.7 重復(fù)性試驗

從同一批次及不同批次EHDV C-ELISA試劑盒中隨機抽取4個試劑盒，分別檢測8份樣品，批次間變異系數(shù)在2.62%～8.72%，批次內(nèi)變異系數(shù)在2.95%～8.89%，變異系數(shù)均小于10%(表6)，表明該試劑盒有較好的批次內(nèi)及批次間重復(fù)性。

表5臨床樣品檢測結(jié)果

Table5ResultsofclinicalsamplestestedbyC-ELISA,RT-PCRandvirusisolation

動物Animal采血日期Date of blood collection檢測結(jié)果a Detection resultsaC-ELISA(PI/%)SNTRT-PCR病毒分離Virus isolation牛-82014-06-2413.95---No. 82014-07-0110.50---2014-07-0812.38-+-2014-07-1561.281∶5++2014-07-2280.251∶28+-2014-07-2983.171∶54--2014-08-0587.651∶80--2014-08-1288.341∶113--2014-08-1888.031∶80--牛-102014-06-1010.33---No. 102014-06-1738.22-+-2014-06-2453.10-++2014-07-0172.691∶20+-2014-07-0877.981∶28+-2014-07-1572.621∶40--2014-07-2282.281∶54--2014-07-2982.401∶80--2014-08-0583.671∶80--牛-212014-07-0810.19---No. 212014-07-1520.37---2014-07-2226.43-+-2014-07-2972.601∶7++2014-08-0582.341∶40+-2014-08-1280.571∶54--2014-08-1883.521∶80--2014-08-2583.511∶113--2014-09-0288.371∶113--牛-72015-07-2818.87---No. 72015-08-0412.55---2015-08-1144.72-++2015-08-1855.67-++2015-08-2570.261∶20+-2015-09-0182.181∶54+-2015-09-0887.031∶113--2015-09-1586.591∶160--2015-09-2888.871∶113--

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

a. 檢測結(jié)果：C-ELISA以“PI/%”表示；SNT以“陰性(-)”或具體數(shù)值表示；RT-PCR、病毒分離試驗以“陰、陽性”表示(+．陽性；-．陰性)

a. Detection results: C-ELISA results are displayed withPI(%); SNT, AGID results are displayed with negative (-) or detailed values; RT-PCR, virus isolation results are displayed with positive or negative (+．Positive；-．Negative)

表6C-ELISA重復(fù)性試驗(n=8)

Table6RepeatabilityassayforC-ELISA(n=8)

樣品序號Sample No.批次內(nèi)Intra batch批次間Inter batch 結(jié)果(x±s)Result變異系數(shù)/%CV結(jié)果(x±s)Result變異系數(shù)/%CV Positive 10.763±0.0202.620.745±0.0222.95Positive 20.845±0.0252.960.857±0.0303.50Positive 30.848±0.0283.300.862±0.0354.06Positive 40.797±0.0243.010.773±0.0314.01Negative 10.210±0.0167.410.214±0.0188.41Negative 20.056±0.0047.620.059±0.0058.47Negative 30.195±0.0178.720.180±0.0168.89Negative 40.130±0.0096.920.133±0.0118.27

2.8 再現(xiàn)性試驗

在3個不同實驗室，用該試劑盒檢測同樣的4份陽性、弱陽性和陰性血清。結(jié)果表明12份血清樣品在3個實驗室的檢測結(jié)果相一致，陰陽性判斷完全正確，變異系數(shù)在1.14%～8.44%之間，均小于10%(表7)，說明該試劑盒再現(xiàn)性較好。

表7再現(xiàn)性試驗

Table7Reproducibilitytestindifferentlaboratories

樣品Sample No.不同實驗室結(jié)果Results of different laboratoryLab 1Lab 2Lab 3x±s變異系數(shù)/%CVPositive 10.8210.7800.8400.814±0.0313.81Positive 20.8190.8110.8570.829±0.0242.95Positive 30.8820.8710.8910.881±0.0101.14Positive 40.8580.8400.8620.853±0.0121.37Weak Positive 10.5070.5240.5320.521±0.0132.41Weak Positive 20.5610.5530.5860.567±0.0183.12Weak Positive 30.5520.5420.5690.554±0.0142.46Weak Positive 40.5920.5810.6220.598±0.0213.55Negative 10.2350.2180.2200.225±0.0094.15Negative 20.1550.1720.1630.163±0.0095.46Negative 30.2190.2470.2560.240±0.0198.01Negative 40.2690.3170.3050.297±0.0258.44

Lab 1.新疆畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)研究所；Lab 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病學(xué)實驗室；Lab 3.云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室

Lab 1. Veterinary Research Institute of Xinjiang Academy of Animal Sciences; Lab 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine of Shanxi Agricultural University; Lab 3. Yunnan Tropical and Subtropical Animal Virus Diseases Laboratory

3 討 論

我國地域遼闊，自然條件復(fù)雜，很多地區(qū)適于各類蟲媒病毒活動，新發(fā)和復(fù)發(fā)蟲媒病毒病更是隨著近年全球變暖而不斷出現(xiàn)。目前，云南、新疆、山西、內(nèi)蒙古、廣西和廣東等地都報道檢測到EHDV陽性血清，并從部分省區(qū)分離到病毒，EHD防控形式嚴峻。

EHDV血清抗體檢測是了解EHDV感染情況的必要手段，目前用于EHDV抗體檢測的方法主要有ELISA、SNT、AGID和補體結(jié)合試驗(complement fixation test，CFT)四種。AGID因其簡單、經(jīng)濟，過去曾被大量使用，但存在需對抗原進行高度濃縮，抗原需求量大等缺點，且因檢測EHDV和BTV血清時存在交叉反應(yīng)，所以該試驗結(jié)果在BTV和EHDV共存地區(qū)不可靠[15]。CFT在1980年以前一直用于血清檢測，可在病毒感染后4～12個月定性及定量測定抗體，但隨后可靠性降低，因此不能用于檢測老疫區(qū)感染[17]。SNT是目前國際上抗體檢測的金標準，有較好的特異性、靈敏度，但有操作要求高、檢測時間長等缺點，并不適于快速診斷和基層單位使用[18]。ELISA具有操作簡便、檢測樣本通量大、當(dāng)天就能出結(jié)果等優(yōu)點，適于大規(guī)模的血清調(diào)查及基層單位使用，已被廣泛應(yīng)用于獸藥殘留檢測及各類疾病診斷等方面[19]。目前，國外有學(xué)者采用EHDV VP7單克隆抗體(群特異性抗體)建立了血清檢測的C-ELISA方法[20]，國內(nèi)有學(xué)者用原核表達VP7蛋白作包被抗原建立間接ELISA方法，但至今已報道的ELISA方法均無商品化試劑盒。為能開展EHDV血清學(xué)調(diào)查相關(guān)工作，本研究選擇建立能進行快速血清檢測的C-ELISA方法。

研究初期，由于制備的多株單克隆抗體未達到使用要求，所以本研究選用豚鼠抗EHDV多抗為競爭抗體，以純化滅活后的EHDV作為包被抗原，HPR標記的羊抗豚鼠為酶標抗體，建立了抗體檢測的C-ELISA方法。由于多克隆抗體競爭位點較多，不可能做到徹底阻斷顯色反應(yīng)，因此建立的C-ELISA方法可能在敏感性和特異性上不如單克隆抗體方法，但在本研究中，通過各反應(yīng)條件的優(yōu)化使陽性血清最高抗體抑制率達90%以上，陰性血清抑制率集中在20%以下。

特異性試驗中，該方法僅能檢測出不同血清型EHDV陽性血清，同相關(guān)病毒陽性血清無交叉反應(yīng)，特別是與EHDV同源性較高，用AGID試驗檢測常出現(xiàn)交叉反應(yīng)的BTV陽性血清，用所建立的C-ELISA方法均能準確區(qū)分。2016年用該方法對云南采集的2 737份牛血清進行C-ELISA檢測，并從檢測為陽性的血清中隨機選出700份進行血清中和試驗確定血清型，結(jié)果存在EHDV-1、2、5、6、7和8不同亞型[9]。結(jié)果說明該方法具有較好的群特異性，但由于本實驗室保存的不同亞型EHDV病毒庫和血清庫還不完整，特異性試驗還需進一步完善。

敏感性試驗中，6種不同血清型的EHDV陽性血清從1∶10倍開始倍比稀釋，同時進行C-ELISA、SNT和AGID檢測，C-ELISA能檢出陽性的血清最大稀釋度均高于SNT和AGID，且1 d內(nèi)出檢測結(jié)果，SNT用了7 d，AGID用了3 d，如果無需確定待檢血清的血清型，ELISA在敏感度和檢測時間上都有優(yōu)勢。

檢測監(jiān)控點連續(xù)4年采集的1 980份血清發(fā)現(xiàn)，該方法檢出血清轉(zhuǎn)陽動物及轉(zhuǎn)陽時間均與SNT、RT-PCR和病毒分離試驗檢測結(jié)果對應(yīng)一致，同時發(fā)現(xiàn)動物被感染后的2～3周內(nèi)為抗體增長期，抑制率迅速升高，之后進入穩(wěn)定期，至次年4月更換動物前抑制率均維持在80%以上，未轉(zhuǎn)陽動物血清持續(xù)檢測均為陰性，說明該方法具有較好的可靠性和穩(wěn)定性。對比4種檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在血清抗體增長期，即核酸檢測陽性后第2周和第3周更易分離到病毒，而核酸陽性僅能維持3～4周，所以可以首先選用C-ELISA方法持續(xù)檢測血清，只需對血清轉(zhuǎn)陽前后5周的抗凝血進行RT-PCR檢測，并將核酸陽性血液接種細胞分離病毒，省去需要對每次采集的血液進行RT-PCR檢測，提高了病毒分離工作效率。對4年間分離的病毒進行基因序列分析和病毒中和試驗鑒定存在EHDV-1、2、5、6、7型，詳細信息另文報道。批次內(nèi)和批次間重復(fù)試驗及在3個不同實驗室間的再現(xiàn)性試驗，CV值均小于10%，說明該方法有較好的重復(fù)性和再現(xiàn)性。

4 結(jié) 論

建立的C-ELISA方法具有較好的特異性、敏感性、應(yīng)用性及重復(fù)性，為我國EHDV抗體檢測提供了一種有效工具，使一些不具備SNT試驗條件的地方也能開展血清檢測，有助于我國進行EHD的血清調(diào)查和防控。