米思遠，師科榮，張瑞強，張海亮，徐慶磊, 俞 英*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100193；2. 山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)是一種含有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科瘟病毒屬?？筛鶕?jù)BVDV 5′端非翻譯區(qū)序列的差異，將BVDV分為BVDV1和BVDV2兩種亞型[1]，近來也有學者將BVDV分為BVDV1、BVDV2與BVDV3三種亞型[2]；另根據(jù)病毒是否會導致宿主細胞的裂解或根據(jù)病毒NS3蛋白的分解產(chǎn)量，將其分為致細胞病變型(cytopathic biotype, cp)和非致細胞病變型(noncytopathic biotype, ncp)兩種生物亞型[3-4]。

BVDV持續(xù)感染(persistent infection，PI)牛對牛群的危害很大[5]，PI牛是指在妊娠母牛懷孕早期感染了ncp型BVDV，其胎兒能夠正常出生、存活，這種胎兒便成為PI牛。PI牛可能本身并沒有臨床癥狀，但是終生帶毒、排毒。感染BVDV的牛會出現(xiàn)一系列的發(fā)病癥狀，如胃腸疾病、生殖功能不全、免疫抑制、黏膜疾病、出血綜合征等。BVDV不僅在牛群上存在嚴重的平行傳播與垂直傳播，而且還會在山羊、綿羊等家畜以及駱駝、羚羊、羊駝、鹿等野生動物之間交叉感染[6-8]。在美國，BVDV造成每年超過4億美元的經(jīng)濟損失，成為該國影響牛健康狀況的最為嚴重的病毒[9]。在世界范圍，每個國家因BVDV造成的平均每頭奶牛的經(jīng)濟損失約為24.85 美元[10]。我國尚未研制出有效針對BVDV的疫苗，如今牧場采取排查并淘汰PI牛的方法來凈化該病毒[11-12]，但是此法仍不能從根本上提高荷斯坦牛對BVDV的抗病力，且耗費大量人力物力。因此，如何從宿主基因組中篩選出抗BVDV的基因以及進一步篩選出抗病牛顯得尤為重要。

小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)存在于所有真核細胞中, 哺乳動物SUMO家族含有4個SUMO類似物, 即SUMO1、SUMO2、SUMO3與SUMO4。SUMO是一類高度保守的蛋白質(zhì)家族, 為大多數(shù)真核細胞生存所必需，SUMO蛋白可同時參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA修復和細胞周期調(diào)控等多種功能調(diào)節(jié)[13-14]。SUMO化是SUMO蛋白參與的一種共價修飾，其在病毒侵染機體的過程中起到至關(guān)重要的作用[15]。有研究表明，被流感病毒(具有轉(zhuǎn)錄活性的病毒)感染的宿主細胞內(nèi)部整體的SUMO化水平明顯增加[16]。SUMO化循環(huán)包括活化、連接、修飾和解離等諸多過程，其中泛素結(jié)合酶9(ubiquitin conjugating enzyme 9, UBC9)是SUMO化唯一的E2(enzyme 2)結(jié)合酶，在底物的識別過程中發(fā)揮著不可替代的作用[17]。有研究者通過干擾胞內(nèi)UBC9的表達，發(fā)現(xiàn)流感病毒的RNA聚集明顯增加，證實了SUMO對病毒的修飾作用[18]。Everett等[19]提出病毒蛋白還會影響宿主SUMO化。韓玉霞[20]研究發(fā)現(xiàn)，BVDV感染能夠影響牛腎細胞(madin-darby bovine kidney cells, MDBK)的SUMO通路。此外，白細胞分化抗原4(cluster of differentiation 4, CD4)的研究大多與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染人體有關(guān)，Catalfamo等[21]發(fā)現(xiàn)與未感染的正常人相比，HIV-1感染者CD4+T淋巴細胞的增殖降低；同時在奶牛疾病方面，CD4基因與奶牛乳房炎等免疫過程存在密不可分的關(guān)系[22-24]。本研究選取SUMO類基因的目的是為了探究在荷斯坦犢牛個體水平的SUMOs表達是否也與BVDV侵染機體存在一定的關(guān)系，選取CD4基因的目的在于探究BVDV侵染荷斯坦牛的免疫過程是否也與CD4的表達變化存在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的42頭荷斯坦犢牛(2月齡以內(nèi))均來自中國北方地區(qū)某奶牛場，采用頸靜脈采血的方式采集犢牛血液(約8 mL)，置于含EDTA的抗凝采血管中。離心分離白細胞并與Trizol試劑混合保存于-80 ℃冰箱，以用于提取RNA。

1.2 主要試劑

Trizol試劑和無核酸酶水購自美國Ambion公司； PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit (目錄號6210A)、RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-Time)(目錄號RR047A)、6×Loading buffer、Taq酶(目錄號R001A)與DNA marker購自TaKaRa公司。

本試驗所選用的引物[7, 20]如表1所示(GenBank暫無牛的SUMO4基因序列)。引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1引物序列

Table1Primersequence

引物名稱Primer name引物序列(5'→3')Primer sequence引物名稱Primer name引物序列(5'→3')Primer sequenceBVDV-FAGCCATGCCCTTAGTAGGACTSUMO3-FGATTACCCATCCTCACCACCA BVDV-RACTCCATGTGCCATGTACASUMO3-RCCAGTCCTTGTCCTCCTCCAG BVDV-1 FGTAGTCGTCAGTGGTTCGUBC9-FGATTACCCATCCTCACCACCABVDV-1 RGCCATGTACAGCAGAGATUBC9-RCCAGTCCTTGTCCTCCTCCAG BVDV-2 FCGACACTCCATTAGTTGAGGCD4-FAGCAGAAAGTGAAACTCGTGGBVDV-2 RGTCCATAACGCCACGAATAGCD4-RACCAACTTCGGCTGATTTGAGSUMO1-FATGTCTGACCAGGAAGCAAAACGAPDH-FGGTGCTGAGTATGTGGTGGASUMO1-RAATCTCACTGCTATCCTGTCCAGAPDH-RGGCATTGCTGACAATCTTGASUMO2-FCTGCCTCATTGACAAACCCTGSUMO2-RAAGCCCAAGGAAGGAGTCAAG

1.3 RNA的提取

提前將樣品放在冰上解凍，取200 μL樣品運用Trizol法提取總RNA，之后加入適量0.01% DEPC處理水(50～100 μL)使RNA沉淀溶解，最后用分光光度計測定RNA濃度，記錄數(shù)值后存放于-80 ℃冰箱待用。

1.4 病毒的分子檢測及分析

有關(guān)BVDV的檢測方法有很多種，每種方法各有優(yōu)劣、有各自適用的情況[25]。本試驗選取了反轉(zhuǎn)錄法來檢測BVDV，操作過程如下：

1.4.1 病毒基因組制備cDNA的過程 采用TaKaRa公司PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行病毒基因組cDNA的制備。

1.4.2 巢式PCR反應 首先將病毒基因組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、外側(cè)上下游引物(BVDV F與BVDV R)、10×PCR buffer、dNTP和雙蒸水按照一定比例在Eppendorf管中進行配制。巢式PCR第一輪反應程序：預變性為94 ℃ 2 min 、30個循環(huán)(變性 98 ℃ 30 s、退火 55 ℃ 30 s與延伸 72 ℃ 30 s)、總延伸 72 ℃ 5 min，保存于4 ℃；再將巢式PCR第一輪PCR產(chǎn)物、TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)、內(nèi)側(cè)上下游引物(BVDV-1 F、BVDV-1 R或BVDV-2 F、BVDV-2 R)、10×PCR buffer、dNTP和雙蒸水按照一定比例在Eppendorf管中進行配制。巢式PCR第二輪反應程序同巢式PCR第一輪反應程序相同。巢式PCR產(chǎn)物用2.0% 瓊脂糖凝膠電泳分離，在紫外燈下成像以檢測犢牛樣品是否感染BVDV。

1.4.3 測序及序列分析 將具有目標條帶的巢式PCR產(chǎn)物送檢測序，以確定目標條帶是否確為BVDV，以及為何種基因型的BVDV；用DNAMAN軟件來分析毒株間的同源性，用MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 相關(guān)候選基因的定量表達分析

根據(jù)病毒檢測的結(jié)果，將所有犢牛樣品分為兩組(BVDV感染組和未感染組)，對所選用的5個相關(guān)候選基因進行熒光定量PCR分析(GAPDH為內(nèi)參基因)。首先運用RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-Time)試劑盒制備cDNA。接下來進行熒光定量PCR反應，按照Blue-SYBR-Green mix 10 μL、Forward primer (10 pmol·μL-1) 1 μL、Reverse primer(10 pmol·μL-1) 1 μL、cDNA溶液 2 μL和ddH2O(試劑盒中自帶) 6 μL的反應體系以及94 ℃預變性 10 min，94 ℃變性40 s，58 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸50 s，變性到延伸循環(huán)35次；熔解曲線形成程序：95 ℃ 5 s，65 ℃ 1 min，97 ℃ 10 s，40 ℃ 10 s的反應條件進行熒光定量PCR分析。最終對熒光定量PCR結(jié)果進行t-test檢驗，找出差異表達的基因。

2 結(jié) 果

2.1 荷斯坦犢牛BVDV分子檢測結(jié)果

對所采集的42頭中國荷斯坦犢牛的血液白細胞進行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增等，最終發(fā)現(xiàn)(圖1)其中13頭犢牛含有BVDV-1型病毒，陽性檢出率達到30.9%，但所有犢牛樣品均沒有發(fā)現(xiàn)BVDV-2型病毒。

圖1 分子檢測荷斯坦犢牛感染BVDV-1、BVDV-2電泳示意圖Fig.1 Electrophoresis figures of BVDV-1 or BVDV-2 infection in Holstein calves via molecular detection

2.2 BVDV-1病毒5′UTR同源性比較與系統(tǒng)進化樹分析

對檢測到BVDV感染的13頭犢牛樣品的巢式PCR產(chǎn)物進行序列測定，對測序結(jié)果進行比對分析，發(fā)現(xiàn)所擴增序列確為BVDV-1型病毒；同時對這13段擴增所得的5′UTR序列(命名為BJCAU01～BJCAU13)運用DNAMAN軟件進行比對分析(圖2a)，發(fā)現(xiàn)這些序列之間的相似性達到95.80%。進一步將這些5′UTR核酸序列與GenBank上BVDV參考毒株對應的5′UTR核酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，各BVDV參考毒株的基因型與登錄號見表2。運用MEGA6軟件最大似然法進行上述序列的統(tǒng)計分析，本研究所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果顯示，這13段5′UTR均屬于BVDV-1亞型，且分別同BJ09_04、605/12-54與BJ09_24參考株具有較高的相似性(圖2b)。

表2BVDV參考毒株信息

Table2TheinformationofBVDVreferencestrains

2.3 相關(guān)候選基因在BVDV感染組與未感染組間的差異表達

根據(jù)巢式PCR檢測結(jié)果，將42頭犢牛分為BVDV感染組與未感染組，進行宿主相關(guān)基因的熒光定量PCR分析，并進行t-test分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所選取的5個BVDV相關(guān)候選基因中有3個基因(SUMO1、SUMO2和SUMO3)的表達量在BVDV感染組與未感染組間存在顯著差異(P<0.05，圖3a、3b、3c)。相比于未感染犢牛，UBC9與CD4基因的表達量在BVDV-1感染牛中有下降趨勢，但均未達顯著性水平(圖3d、3e)。

△.本研究獲得的BVDV;▲.高同源性的參考毒株△.BVDV detected in the current study; ▲.Reference strains of high homology圖2 BVDV病毒5′UTR相似性比較(a)與系統(tǒng)進化樹分析(b)Fig.2 Comparison of homology (a) of 5′UTR of BVDV and phylogenetic tree (b)

*.P<0.05圖3 BVDV感染相關(guān)候選基因在感染組與未感染組犢牛間的mRNA差異表達Fig.3 The differences of mRNA expression levels of BVDV-infection related candidate genes between the infected and uninfected calves

3 討 論

本試驗采取的反轉(zhuǎn)錄法能夠有效檢測BVDV以及分析被感染牛BVDV的類型。42頭犢牛的BVDV-1陽性檢出率為30.9%，試驗結(jié)果沒有發(fā)現(xiàn)BVDV-2型病毒的存在，這也符合當前我國BVDV的流行趨勢。本研究針對BVDV抗性候選基因的熒光定量結(jié)果表明，與未感染BVDV-1犢牛相比，感染BVDV-1犢牛SUMO1、SUMO2與SUMO3基因表達量均呈現(xiàn)顯著性下調(diào)。

值得注意的是，SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白會與SUMO化的E3連接酶、細胞內(nèi)的其他蛋白共同組成早幼粒白血病核小體相關(guān)蛋白(promyelocytic leukaemia protein nuclear bodies，PML NBs)。PML NBs在基因表達調(diào)控、細胞凋亡和抵抗病毒入侵等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用；而許多病毒蛋白也會破壞PML NBs來抵抗宿主的免疫過程[19]。韓玉霞[20]發(fā)現(xiàn)，沉默MDBK細胞的SUMO1基因會促進BVDV的復制；本研究熒光定量PCR結(jié)果表明，相比于健康犢牛而言，BVDV-1感染犢牛SUMO1、SUMO2和SUMO3基因的相對表達量顯著下調(diào)。結(jié)合前人研究與本研究結(jié)果是否可以提出這樣的假說：機體在受到BVDV-1侵染的過程中，PML NBs很可能參與了抵抗BVDV-1侵染的免疫過程。如果SUMO1、SUMO2、SUMO3被沉默或表達量不足會導致PML NBs合成量的降低，由此BVDV-1病毒就能夠免受機體的免疫調(diào)控[19-20]。研究表明，許多病毒蛋白自身需要被SUMO化[16,19]。韓玉霞的試驗發(fā)現(xiàn)，沉默MDBK細胞UBC9基因會抑制BVDV的復制，這可能是因為UBC9是SUMO化唯一的E2結(jié)合酶，若UBC9被沉默或表達量下調(diào)，就不能產(chǎn)生足夠成熟的SUMO化病毒蛋白，從而抑制了BVDV-1的復制。最后，我們將前人與本試驗的研究結(jié)果進行整合[19-20,26]，繪制了BVDV-1侵染機體與宿主SUMO化相關(guān)基因表達之間的關(guān)系示意圖(圖4)。

左半圖為BVDV-1未感染細胞。a～d為體內(nèi)SUMO化過程[19]：a. SUMO1、SUMO2和SUMO3轉(zhuǎn)錄翻譯為SUMO蛋白；b. E1酶參與下的SUMO蛋白激活過程；c. UBC9與SUMO蛋白結(jié)合；d. 在UBC9與E3連接酶的作用下，底物蛋白被SUMO化。右半圖為BVDV-1感染細胞。A～G為SUMO化與BVDV-1復制的關(guān)系[19-20,26]：A. BVDV-1病毒通過一系列過程進入宿主細胞；B. BVDV-1病毒復制產(chǎn)生子代病毒；C. 病毒產(chǎn)生的蛋白可能需要SUMO化才能形成成熟蛋白；D. BVDV-1病毒的侵染會導致機體內(nèi)SUMO1、SUMO2和SUMO3轉(zhuǎn)錄水平下降；E. SUMO1、SUMO2和SUMO3轉(zhuǎn)錄翻譯為SUMO蛋白；F. PML NBs形成；G.PML NBs干擾BVDV-1病毒繁殖Left panel is BVDV-1 uninfected cell: a-d show the process of sumoylation in vivo[19]: a. SUMO1, SUMO2 and SUMO3 are transcribed and translated into SUMO; b. SUMO is activated by E1 enzyme; c. Activated SUMO is transferred to UBC9; d. UBC9 catalyses the conjunction of SUMO to target proteins in concert with SUMO E3 ligase. Right panel is BVDV-1 infected cell: A-G show the relationship between BVDV-1 reproduction and sumoylation[19-20,26]: A. BVDV-1 enters the cell; B. BVDV-1 reproduces progeny virus; C. Some proteins produced by BVDV-1 need to be sumoylated; D. BVDV-1 infects cell that will reduce the transcription level of SUMO1, SUMO2 and SUMO3 in vivo; E. SUMO1, SUMO2 and SUMO3 are transcribed and translated into SUMO; F. The formation of PML NBs; G. PML NBs can interfere the reproduction of BVDV-1圖4 BVDV-1侵染機體與宿主SUMO化相關(guān)基因表達之間的關(guān)系圖Fig.4 The relationship between the BVDV-1 infection and the expression of SUMO genes expression in the host cells

試驗結(jié)果顯示，CD4基因的mRNA相對表達量在BVDV-1感染組與健康組之間未達到顯著性差異，但在感染組有下降的趨勢。Falkenberg等[27]檢測了在接種BVDV-2后14 d的荷斯坦犢牛組織樣品，發(fā)現(xiàn)相比于陰性對照的健康組，BVDV-2高毒力感染組的CD4+T細胞數(shù)量有上升趨勢，而BVDV-2低毒力感染組的CD4+T細胞數(shù)量有下降趨勢，在大多組織中差異未達到顯著性水平。因此，CD4基因與BVDV侵染的關(guān)系可能比較復雜，還需進一步深入研究。

4 結(jié) 論

本試驗所采用的BVDV檢測方法為病原檢測方法，能夠有效地從犢牛血液中檢測BVDV的感染情況。BVDV的相似性較高，在北京地區(qū)奶牛場檢測到的BVDV-1毒株并未發(fā)生大規(guī)模的突變現(xiàn)象，未檢測到BVDV-2毒株。本研究發(fā)現(xiàn)，感染BVDV-1的犢牛其白細胞中的SUMO1、SUMO2與SUMO3表達量顯著低于未感染犢牛，表明BVDV-1侵染宿主的過程很可能與宿主體內(nèi)的SUMO蛋白存在相互作用機制，提示SUMO1、SUMO2與SUMO3可能與BVDV-1侵染機體的細胞通路有關(guān)。