黃冬麗，丁功濤，王福彬

（西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730124）

促性腺釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH），是一種由下丘腦分泌，用來刺激或抑制垂體促性腺激素的分泌，以調控脊椎動物生殖系統(tǒng)功能的十肽神經激素［1］。內源性GnRH是由下丘腦的GnRH神經元合成并釋放，通過垂體門靜脈系統(tǒng)作用于垂體前葉的GnRH受體，從而刺激垂體合成并釋放促黃體生成激素（Luteinizing hormone，LH）和促卵泡激素（Folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH）［2-5］。自 1971 年從豬和羊的腦分離出GnRH以來，到目前GnRH家族至少已有28個類型，其中15種來自脊椎動物，13種來自無脊椎動物。除章魚GnRH外，所有GnRH肽都由10個氨基酸組成，其分子長度和部分氨基酸序列非常保守。哺乳動物的GnRH基因內有3個內含子和4個外顯子，屬單拷貝基因，其中第2、3個外顯子和部分第4個外顯子編碼GnRH蛋白前體［3］。

目前，國內對于GnRH的研究大多集中在基因克隆與表達方面，但對編碼蛋白的性質和功能及基因的同源性方面的研究卻鮮有報道［6-7］。因此，為深入研究小尾寒羊GnRH基因編碼蛋白的性質、功能及基因的同源性，本研究采用生物信息學方法對小尾寒羊GnRH基因編碼產物的理化特性和蛋白質結構功能進行了預測分析；同時借助MEGA軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，對GnRH基因在不同物種間的同源性進行分析，以期為今后關于GnRH基因多態(tài)性及功能的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 小尾寒羊GnRH基因序列來源

小尾寒羊的GnRH基因CDS區(qū)序列由NCBI上查找獲得（GeneBank no：NM-00100937）。

1.2 方法

對小尾寒羊GnRH基因CDS編碼產物的理化特性、功能預測及基因的同源性進化關系的分析與預測所用的軟件及網址見表1。

表1 對小尾寒羊GnRH基因進行生物信息學分析的主要軟件

2 結果與分析

2.1 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質理化性質

小尾寒羊的GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質理化性質分析結果表明，羊的GnRH基因CDS區(qū)編碼328個氨基酸。20種氨基酸所占數(shù)量如圖1所示，其中占整個氨基酸組成比重最大的為亮氨酸（Leu），占比49%；比重最小的為谷氨酸（Glu），占比5%。負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）15，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）27，其分子式C1762H2696N432O446S20，分子質量37 708 kDa，基因編碼產物半衰期30 h，等電點9.39，不穩(wěn)定指數(shù)32.51，其中不穩(wěn)定指數(shù)小于40，可判定該基因編碼產物為穩(wěn)定蛋白。

圖1 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白的氨基酸組成預測

2.2 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質的親疏水性預測

小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼氨基酸序列親水性/疏水性預測結果如圖2所示，其中第225位亮氨酸（Leu）疏水性最強，疏水分值+3.300；第68位的谷氨酸（Glu）親水性最強，親水分值-3.311。整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占32.5%，疏水氨基酸占67.5%，總平均疏水性分值+0.175，總體表現(xiàn)為疏水性，故可推斷小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼產物是一種不溶于水的蛋白質。

圖2 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼的蛋白質疏水性/親水性預測分析

2.3 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼的蛋白質結構預測

2.3.1 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質二級結構分析 如圖3所示，二級結構組分中α-螺旋（Hh）、β-折疊（Ee）、β-轉角（Tt）和無規(guī)則卷曲（Cc）分別占37.20%、25.61%、2.74%、34.45%。從中可以看出，GnRH基因編碼的二級結構中α-螺旋占主導地位，其次是無規(guī)則卷曲。根據(jù)二級結構中α-螺旋所占比例小于40%，無規(guī)則卷曲所占比例大于20%，故可以推斷該基因編碼的蛋白質為混合型二級結構。

圖3 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質的二級結構預測

2.3.2 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質三級結構分析 由圖4可知，小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白三級結構中主要成分也是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，與二級結構預測結果相符。

圖4 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質的三級結構預測

2.4 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼的蛋白質功能預測

小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼的蛋白質功能預測結果表明（表2），該蛋白在信號轉導、免疫應答過程以及生長因子和荷爾蒙分泌中發(fā)揮作用的幾率相對較高，分別為1.271%、1.447%、2.857%和17.528%。從中可以看出，在荷爾蒙分泌中發(fā)揮作用的幾率最高，這表明GnRH基因在動物機體性激素的釋放上發(fā)揮關鍵作用；同時，還可以預測GnRH基因在羊的生長代謝和免疫調節(jié)上也發(fā)揮重要作用，與羊繁殖力的提高顯著相關［8-9］。

表2 小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼蛋白質功能預測%

2.5 小尾寒羊GnRH基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹構建

使用MEGA軟件對11個物種GnRH基因編碼產物進行同源性分析，并構建發(fā)育進化樹（圖5）。結果表明，不同物種之間的GnRH基因在進化上具有高度的同源性和保守性，在多數(shù)哺乳動物中都有表達［10］，其中，小尾寒羊與山羊GnRH基因的同源性最高。同時還發(fā)現(xiàn)，偶蹄目的綿羊、山羊、水牛和牦牛等親緣關系較近，GnRH基因同源性較高；而與靈長目、嚙齒目、翼手目和鯨目的親緣關系較遠，GnRH基因同源性較低。

圖5 小尾寒羊GnRH基因系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

GnRH基因通過指導蛋白質的合成，控制蛋白質結構，從而間接地對生物體性狀發(fā)揮作用。本研究通過生物信息學方法對小尾寒羊GnRH基因CDS區(qū)編碼的蛋白質的理化性質、結構功能以及基因的同源關系進行分析，并對結果進行討論。對蛋白質的理化性質分析結果表明，GnRH基因CDS區(qū)由96個堿基對組成，共編碼328個氨基酸，編碼產物具有較長的半衰期和較高的穩(wěn)定系數(shù)，蛋白質總體表現(xiàn)為不溶于水的穩(wěn)定蛋白。賈浩等［11］研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質的半衰期與穩(wěn)定系數(shù)成正比，半衰期越長穩(wěn)定系數(shù)越高，這與本研究分析結果一致。

蛋白質的生物學活性不僅決定于蛋白質分子的一級結構，而且與其特定的空間結構密切相關。因此，在對蛋白質的功能進行預測分析時，就必須要清楚蛋白質的空間結構組成。本研究通過生物信息學方法對蛋白質的二級結構和三級結構進行預測分析，結果表明該基因編碼產物的二級結構主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成，它們的占比分別為37.20%和34.45%。由于無規(guī)則卷曲（Cc）所占比例大于20%，α-螺旋（Hh）所占比例小于45%，因此可以推斷，該基因編碼蛋白質的二級結構為混合型。由于蛋白質的二級結構中α-螺旋的占比較大，因此該基因編碼產物較穩(wěn)定，這與蛋白質理化性質的分析結果一致。

在預測分析蛋白質功能的結果中發(fā)現(xiàn)，該蛋白在信號轉導、免疫應答過程以及生長因子和荷爾蒙分泌中發(fā)揮作用的幾率相對較高，由此說明GnRH基因CDS區(qū)編碼的蛋白質對生殖過程中性激素的分泌調控起著中心作用，是性行為的重要介導者［12］。GnRH雖在動物體內含量極低，但卻發(fā)揮著及其重要的作用，它不僅調節(jié)動物機體的生殖過程，還對動物機體的免疫應答和生長代謝起著重要作用［13］。最新研究表明，腫瘤細胞中的GnRH可抑制癌細胞的增殖，并且GnRH還對消化系統(tǒng)的功能起調節(jié)作用。

最后，在對小尾寒羊GnRH基因同源關系進行分析的結果中發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊與山羊GnRH基因同源性最高，親緣關系最近；同時在對?？苿游颎nRH基因進行分析時發(fā)現(xiàn)，小尾寒羊與其基因的同源性也較高。在動物分類學上，牛和羊同屬?？?，分屬于不同亞科，因此，本研究可以為今后關于GnRH基因在不同亞科動物之間功能的聯(lián)系提供理論基礎。