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        2016年中國部分地區(qū)白斑綜合征病毒高變異區(qū)序列的分析比較

        2018-08-07 06:30:48孫新穎劉慶慧萬曉媛
        海洋漁業(yè) 2018年4期
        關(guān)鍵詞:堿基唐山條帶

        蔡 苗,孫新穎,劉慶慧,萬曉媛,黃 倢

        (1.青島海洋科學與技術(shù)國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室,農(nóng)業(yè)部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室,青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室,中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島 266071;2.水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心,上海海洋大學,上海 201306;3.濟南大學前沿交叉科學研究院,濟南 250022)

        對蝦養(yǎng)殖作為水產(chǎn)品養(yǎng)殖行業(yè)中的重要的組成部分,其發(fā)展面臨著水質(zhì)、氣候以及濫用藥物等一系列問題的威脅,但最主要的還是病害問題,近年來這一問題也呈現(xiàn)出日益嚴重的趨勢[1-3]。白斑綜合征病毒 (white spot syndrome virus,WSSV)是對蝦養(yǎng)殖行業(yè)中存在的主要病原之一,自從20世紀90年代首次爆發(fā)以來,引起了全球?qū)ξr養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的廣泛關(guān)注,同時也對全世界各地的對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[4]。白斑綜合征病毒是一類無包涵體的具囊膜、一端有尾巴狀結(jié)構(gòu)、桿狀的雙鏈環(huán)狀DNA病毒[2],大小約為300 kb,感染后在數(shù)天內(nèi)死亡率可達100%[5]。2005年國際病毒分類委員會第7次報告提出把 WSSV歸入到線形病毒科(Nimaviridae)白斑病毒屬(Whispovirus),它是此新科中唯一的成員[6]。迄今為止,GenBank上共公布了7個WSSV基因全序列,研究最多的分別有中國大陸株(WSV-CN,KT995472)、中國臺灣株(WSSV-TW,AF440570)和泰國株(WSSV-TH,AY753327),其中泰國株具有目前最大的基因組312 kb,被假定成為祖先株[7]。通過基因組全序列比對發(fā)現(xiàn)這3個毒株的基因組序列有約99%的核苷酸保持一致性,存在的主要的差異分別是:1)大片段序列插入/缺失;2)易于發(fā)生基因重組的變異區(qū);3)開放性閱讀框(open reading frames,ORFs)內(nèi)出現(xiàn)的重復單元變化差異(variable number tandem repeat,VNTR);4)轉(zhuǎn)座酶基因序列存在與否;5)單核苷酸的缺失、插入及 多 態(tài) 性 (single-nucleotide polymorphisms,SNPs)[8-9]。目前應用于 WSSV流行病學研究的主要有 ORF14/15和 ORF23/24的缺失變化,ORF75、ORF94和 ORF125的 VNTR及SNPs[10-12]。有研究表明,在可變區(qū) ORF14/15和ORF23/24上出現(xiàn)的大片段缺失情況與地理位置有關(guān)[11],其中可變區(qū) ORF14/15通過重組逐步形成,而可變區(qū)ORF23/24常出現(xiàn)大片段缺失;在ORF75上有兩種重復單元(repeat units,RUs),分別為 45 bp和 102 bp,在第 3、15、30、40、42、44和83個堿基處存在多態(tài)性;ORF94上的RUs大小為54 bp,在48位有多態(tài)性;而ORF125上的RUs有69 bp,第1、2和倒數(shù)第 1個重復單元有其特有的SNP,從第3到倒數(shù)第2個重復單元在第 8、18、25、66和 69位堿基具有多態(tài)性[9,11]。在之前有關(guān)WSSV流行病學的研究中大多只涉及到重復單元的數(shù)量,然而對于每個重復單元都可能存在單核苷酸的缺失、插入及多態(tài)性。因此僅僅考慮重復單元的數(shù)量而忽略單核苷酸多態(tài)性則可能得不到理想的流行病學調(diào)查結(jié)果。

        本實驗選取2016年1-7月從中國部分地區(qū)采集到的47份WSSV陽性樣本,通過特定引物對目的片段進行擴增,繼而進行測序并分析比較不同地區(qū)樣本的ORF14/15和ORF23/24序列缺失情況,ORF75、ORF94和 ORF125的 VNTR及SNPs變化情況,并以此來探討WSSV不同毒株間的遺傳進化差異,以期為WSSV分子流行病學研究提供參考資料。

        1 材料與方法

        1.1 樣本來源

        本實驗室于2016年1-7月WSSV病害爆發(fā)期間,在山東、河北和浙江3省采集到47份患病樣本,所有實驗樣本采集后均置于-80℃的冰箱冷凍保存。樣本信息見表1。

        1.2 病毒核酸提取

        取約30 mg鰓組織,進行DNA提取,提取產(chǎn)物置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.3 PCR檢測

        按照 GB/T 28630.2-2012白斑綜合征(WSD)診斷規(guī)程第2部分套式PCR檢測法對DNA樣本進行WSSV檢測。而后通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

        1.4 目的基因擴增

        將1.3中檢測呈WSSV陽性的樣本通過特定引物進行擴增,采用25uL的體系:10×PCR反應緩沖液(含 Mg2+)2.5μL,雙蒸水 17.3μL,dNTP 2μL,正向與反向引物各 0.5μL,Ex Taq DNA聚合酶0.2μL,WSSV模板1μL。PCR擴增中使用的引物與反應條件見表2。

        1.5 目的基因克隆及片段分析

        將1.4中的陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后與載體 pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細胞,在LB肉湯培養(yǎng)液中37℃振蕩含1 h復蘇抗性。然后涂在含有氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上,37℃過夜培養(yǎng)。每個平板挑取至少5個單菌落接種于添加氨芐青霉素的LB肉湯培養(yǎng)液中37℃振蕩4 h,取培養(yǎng)物為模板按1.4方法進行鑒定。將PCR鑒定為陽性的菌液全部送到上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行DNA雙向測序。測序結(jié)果用DNAMAN 8軟件進行序列比對分析,ORF14/15和ORF23/24片段分別與泰國株(TH-96-II)和中國臺灣株(TW)比對[13],分析序列缺失情況;ORF75、ORF94和ORF125測序結(jié)果進行VNTR以及SNPs分析[12]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 套式PCR結(jié)果

        WSSV病害暴發(fā)區(qū)采集到47份樣本中,共有33份樣本在第1輪擴增中呈現(xiàn)WSSV陽性,其余14份樣本均在第2輪擴增中呈現(xiàn)陽性。

        表1 樣本采集信息及ORF75、ORF94和ORF125重復單元數(shù)目Tab.1 Samples information and repeat units(RUs)present in ORF75,ORF94 and ORF125

        表2 PCR擴增引物以及反應條件Tab.2 PCR primers and cycling conditions

        2.2 目的基因擴增結(jié)果

        在WSSV樣本擴增中有23份樣本(2#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、13#、15#、17#、19#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#、41#、42#、43#、44#、45#)出現(xiàn)ORF14/15的目的條帶,成功擴增樣品比率為48.94%,其中13#、15#和19#樣本的目的條帶與其它條帶相比片段明顯大,山東濱州、河北秦皇島和浙江寧波、湖州地區(qū)樣本未有陽性條帶出現(xiàn)(圖1)。而在ORF23/24擴增中,有10份樣本(6#、13#、19#、28#、29#、34#、35#、36#、40#、41#)有目的條帶檢出,檢出率為21.28%,條帶大小相差不明顯,山東青島、濱州和浙江寧波、湖州地區(qū)的樣本均未檢出(圖2)。在ORF75擴增中,除了山東青島、濱州,河北黃驊、秦皇島和浙江寧波、湖州的樣本外,共有 8份樣本(13#、15#、19#、34#、35#、36#、40#、41#)出現(xiàn)相應的陽性條帶,檢出率為17.02%,13#、15#、19#樣本目的條帶較之其它條帶偏大(圖3)。在ORF94擴增中,有13份樣本(12#、13#、14#、15#、16#、18#、19#、25#、39#、40#、41#、42#、45#)出現(xiàn)相應目的條帶,山東青島、濱州,河北黃驊和浙江湖州樣本未檢出,檢出率為27.66%(圖4)。在ORF125擴增中,共有20個樣本(6#、13#、14#、15#、16#、18#、19#、28#、29#、30#、31#、34#、35#、36#、37#、38#、39#、40#、41#、42#)檢出,檢出率為42.55%,而山東青島、濱州和浙江湖州的樣本未檢出(圖5)。

        圖1 ORF14/15的擴增結(jié)果Fig.1 Amplification result of ORF14/15注:M:DNA Maker DL 2000;(+)陽性對照,(-)陰性對照;1~47:樣本編號Note:M:DNA Maker DL 2000;(+)positive control,(-)negative control;1~47:number of samples

        圖2 ORF23/24的擴增結(jié)果Fig.2 Amplification result of ORF23/24注:M:DNA Maker DL 2000;(+)陽性對照,(-)陰性對照;1~47:樣本編號Note:M:DNA Maker DL 2000;(+)positive control,(-)negative control;1~47:number of samples

        圖3 ORF75的擴增結(jié)果Fig.3 Amplification result of ORF75注:M:DNA Maker DL 2000;(+)陽性對照,(-)陰性對照;1~47:樣本編號Note:M:DNA Maker DL 2000;(+)positive control,(-)negative control;1~47:number of samples

        圖4 ORF94的擴增Fig.4 Amplification of ORF94注:M:DNA Maker DL 2000;(+)陽性對照,(-)陰性對照;1~47:樣本編號Note:M:DNA Maker DL 2000;(+)positive control,(-)negative control;1~47:number of samples

        圖5 ORF125擴增Fig.5 Amplification of ORF125注:M:DNA Maker DL 2000;(+)陽性對照,(-)陰性對照;1~47:樣本編號Note:M:DNA Maker DL 2000;(+)positive control,(-)negative control;1~47:number of samples

        2.3 序列比對

        在ORF14/15擴增中,共得到4種大小不同的片段,即1 260 bp(山東青島、河北黃驊)、1 270 bp(河北黃驊、唐山、滄州)、1 850 bp(河北唐山)和2 660 bp(山東日照、河北滄州),通過與該片段最為完整的TH-96-II(AY753327)進行序列比對,分別缺失 6 540 bp、6 530 bp、5950 bp和5 140 bp(圖6)。在ORF23/24擴增中共得到3種片段,分別是1 137 bp(河北黃驊、山東日照)、1 140 bp(河北滄州、秦皇島)和1 265 bp(河北唐山),同此段區(qū)域最完整的中國臺灣株[TW(AF440570)]進行序列比對,缺失長度分別為12 073 bp、12 070 bp、11 945 bp(圖7)。

        圖6 WSSV不同毒株ORF14/15序列比對Fig.6 Sequence alignment of ORF14/15 in different WSSV strains注:KR:韓國株(JX515788);TH:泰國株(AF369029);TW:中國臺灣株(AF440570);CN:中國株(AF332093).兩側(cè)的矩形表示擴增出的序列,括號內(nèi)數(shù)字表示擴增出片段的大小,中間的虛線表示與TH-96-II毒株序列比對缺失的序列Note:KR:South Korean plant(JX515788);TH:Thai strain(AF369029);TW:China Taiwan strain(AF440570);CN:China plant(AF332093).Rectangles indicate sequences amplified by ORF14/15,figures in the bracket indicate the length of the amplified fragments,the dotted lines indicate sequences deletions compared with the TH-96-II strain

        圖7 WSSV不同毒株ORF23/24區(qū)域的序列比對Fig.7 Sequence alignment of ORF23/24 in different WSSV strains注:兩側(cè)的矩形表示擴增出的序列,括號內(nèi)數(shù)字表示擴增出片段的大小,中間的虛線表示與TW毒株序列比對缺失的序列Note:Rectangles indicate sequences amplified by ORF23/24,figures in the bracket indicate the length of the amplified fragments,the dotted lines indicate sequences deletions compared with the TW strain

        在ORF75擴增中,出現(xiàn)了4種大小不一的片段,分別為2 503 bp、2 310 bp、2 341 bp和 1 739 bp,將片段與重復單元比對可知,RUs數(shù)目分別為11(山東日照)、8(山東日照)、10(河北滄州)、3(河北唐山)(圖8)。ORF94擴增中,共擴增出5種片段,分別為 590 bp、698 bp、749 bp、916 bp、1 078 bp,RUs數(shù)目分別為 5(河北秦皇島)、7(河北滄州、唐山)、8(山東日照)、11(浙江寧波、山東日照)、14(山東日照、河北唐山)(表 1)。VNTR和SPNs分析顯示,含有5個RUs的ORF94片段在48位的堿基為 T、T、T、T、T,含有 7個 RUs的ORF94在48位的堿基為 T、G、G、G、G、T、T,含有8個RUs的ORF94片段在48位的堿基為T、T、T、T、T、T、T、T,含有 11個 RUs的 ORF94片段在48位的堿基為 T、T、T、T、T、T、G、T、G、T、T,而含有14個RUs的ORF94在48位的堿基為T、T、T、T、G、G、T、G、G、T、T、T、T、T(表 3)。在 ORF125擴增中,共得到3種不同的片段,分別為652 bp、721 bp和790 bp,RUs數(shù)目分別為4(山東日照、河北唐山)、5(河北黃驊、滄州、秦皇島、唐山)、6(山東日照、浙江寧波、河北滄州、唐山)。在ORF125的所有VNTR類型中,不考慮3個特殊RUs,結(jié)果顯示所有類型在8、18、25、66和69位置的堿基均為 G、G、G、G和 A;而在 9、50、53、61和63位堿基上出現(xiàn)了4種變異(表4)。

        圖8 ORF75區(qū)域RUs情況Fig.8 The RUs of ORF75 region注:黑長方體代表45 bp的重復單元,紅長方體代表102 bp的重復單元Note:The black cubes represent 45 bp RUs and the red cubes represent 102 bp RUs

        表3 ORF94區(qū)域各重復單元在48位的單核苷酸多態(tài)性Tab.3 Single-nucleotide polymorphisms(SNPs)patterns at position 48 of ORF94 region

        表4 ORF125區(qū)域各重復單元在9、50、53、61和63位點的單核苷酸多態(tài)性Tab.4 Single-nucleotide polymorphisms(SNPs)patterns at position 9,50,53,61 and 63 of ORF94 region

        3 討論

        本研究取用2016年1-7月從我國3省9市包括山東的青島、日照和濱州,河北的黃驊、滄州、秦皇島和唐山,浙江的寧波和湖州的發(fā)病地區(qū)采集到的47份WSSV陽性樣本,以特定的引物擴增目的片段,通過測序分析不同樣本的缺失及變異情況。序列比對結(jié)果顯示,在開放閱讀框ORF14/15的擴增中,分別有6 540 bp、6 530 bp、5 950 bp和5 140 bp的片段缺失,最大程度的缺失為6 540 bp,出現(xiàn)在山東青島、河北黃驊地區(qū)的樣本中,本實驗室孫新穎等[14]在研究中發(fā)現(xiàn),河北黃驊、曹妃甸、浙江溫州和廣東江門地區(qū)的樣本也出現(xiàn)相同的缺失片段;河北黃驊、唐山、滄州的樣本得到了缺失6 530 bp的片段,本實驗室孫新穎等[15]在2013年和2014年的樣本中均得到相同的缺失情況;本實驗中河北唐山樣本中出現(xiàn)了缺失程度為5 950 bp的片段,這與TANG等[16]對于馬達加斯加島、莫桑比亞和查特阿拉伯地區(qū)毒株的實驗結(jié)果一致,HOA等[17]對印度和越南南部地區(qū)毒株的調(diào)查中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果。山東日照和河北滄州樣本擴增中得到了最大片段,長度為2 660 bp,缺失片段為5 140 bp,與中國臺灣株(TW)僅僅相差兩個堿基。

        在ORF23/24擴增中,共得到3種PCR擴增產(chǎn)物,分別為1 137 bp、1 140 bp和1 265 bp,1 137 bp片段與1 140 bp片段相比,保留了9個堿基的一段GATTTCATC序列,而缺少12個堿基的一段AGAGGAAGAAGA序列。已報道中國臺灣株(TW)的ORF23/24片段最為完整,因此通常將ORF23/24與TW進行比對。目前,已知泰國株具有最大的缺失片段為13 120 bp,韓國株缺失程度居中,為5 654 bp,而中國株缺失片段最小,僅1 169 bp。本研究中出現(xiàn)的3種缺失情況,分別為 12 073 bp、12 070 bp、11 945 bp,均屬于較大程度的片段缺失,其中12 070 bp的缺失片段也分別出現(xiàn)在2013年和2014年的樣本中[14-15]。在MARKS等[18]和 ZWART等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)缺失大片段后保留的短片段在復制時往往具有優(yōu)勢,可能與自身的毒力有關(guān)。

        在各地區(qū)樣本的ORF75中,重復單元數(shù)目差異比較明顯,而相同地區(qū)樣本之間也存在差異,例如同樣是山東日照樣本,RUs數(shù)目存在11和8兩種情況;河北唐山樣本所含的RUs數(shù)目最少,僅為3,這也在同年安徽池州的克氏原螯蝦(Procambarus clarkii前國內(nèi)外報道的最小的ORF75 RUs組合,該組合為102 bp、45 bp和45 bp,與安徽池州的克氏原螯蝦的3RUs一致,其它地區(qū)樣本ORF75 RUs組合均以45 bp、102 bp和45 bp開始,這與大多已報道的毒株結(jié)果類似[20-23];從圖 8可以看出,某些 RUs的位置存在保守性,相似片段可能是由于變異得到。

        在ORF94擴增中,河北秦皇島的樣本得到了最小的片段,為590 bp,有5個 RUs,最大片段1 078 bp中有14個RUs,這表明相同地區(qū)樣本中的RUs也有差異。HOA等[17]在對印度和越南的WSSV毒株的研究中發(fā)現(xiàn)病害爆發(fā)區(qū)的WSSV ORF94 RUs數(shù)目大多都小于 8。MARKS等[18]發(fā)現(xiàn)攜帶多種變異毒株的宿主,經(jīng)過繁殖1~2代,大多只能檢測到基因組小的毒株,因此推測RU數(shù)目少的WSSV更容易在傳播過程中存活而保留下來[20],這與之前提到的關(guān)于 ORF23/24缺失大片段后保留的短片段在復制時往往具有優(yōu)勢的結(jié)論一致。

        在ORF125擴增中,共有3種片段,RUs數(shù)目為 4、5、6,已有的報道顯示,WSSV ORF125 RUs的第 8、18、25、66和 69位點存在 SNPs[13,22],而本實驗中所有樣本在8、18、25、66和69位置的堿基均為 G、G、G、G和A,而在9、50、53、61和63位堿基上出現(xiàn)了SNPs。TANG[16]在2013年的研究中發(fā)現(xiàn),ORF75的重復單元數(shù)目相同;而大多數(shù)樣本均出現(xiàn)ORF94序列缺失,僅有極個別樣本出現(xiàn)了數(shù)目不等的RUs;ORF125的RUs數(shù)目也存在差異。MUSTHAQ等[12]和 WAIKHOM等[23]的實驗表明,ORF94在不同宿主中存在一定程度的VNTR。然而 GUDKOVS等[10]研究 中 發(fā)現(xiàn),ORF94的 RUs沒有任何差異。SINDHUPRIYA等[24]的實驗表明,ORF94的 RUs存在細微的差異,而ORF75和ORF125不存在VNTR。因此僅僅考慮重復單元的數(shù)量的差異(VNTR)而忽視單核苷酸多態(tài)性(SNPs)則可能得不到理想的流行病學調(diào)查結(jié)果。通過增加SNPs的分析則有助于進一步區(qū)分具有相同VNTR的毒株。在本實驗中,不同地區(qū)的樣本的ORF94和ORF125均存在VNTR,SNPs的分析結(jié)果則進一步顯示出樣本之間的差異性。

        本研究結(jié)果表明,2016年的樣本中,WSSV毒株存在一定程度的變異情況,其中ORF14/15和ORF23/24均出現(xiàn)了新的缺失片段,ORF75、ORF94和ORF125的VNTR以及SNPs變化情況也存在明顯差異,但總體較2013年和2014年的樣本表現(xiàn)出部分穩(wěn)定性。因此可以推測,WSSV毒株的不斷變異是為了更好地適應環(huán)境,但變異是否導致WSSV致病性的變化以及變化機制還有待進一步研究。

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