李國烈，杜 鑫，蘇 旭，覃明麗，蔣金芳

(南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，四川 南充 637000)

吡蟲啉和啶蟲脒是新一代煙堿類農(nóng)藥，具有殺蟲譜廣、持效期長、內(nèi)吸性強(qiáng)、不易揮發(fā)、高效、低毒等特點(diǎn)[1-2]。吡蟲啉能有效防治鞘翅目、同翅目、鱗翅目和雙翅目類害蟲，同時(shí)可殺滅對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥等傳統(tǒng)殺蟲劑有抗藥性的害蟲[3-4]。啶蟲脒是吡蟲啉的一種開環(huán)衍生物，除具有吡蟲啉良好的殺蟲活性外，還有優(yōu)良的殺卵活性，而且與常規(guī)農(nóng)藥無交互抗性[5]。由于這兩種殺蟲劑的顯著優(yōu)勢(shì)，近年來被廣泛用于果桑生產(chǎn)中，主要用于防治桑木虱、白粉虱、蚜蟲、桑毛蟲、桑椹癭蚊、桑尺蠖、桑天牛、桑薊馬和紅蜘蛛等病蟲害[6-11]。但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于用藥不當(dāng)會(huì)造成桑葚中化學(xué)農(nóng)藥殘留污染，危害人類健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[12]。到目前為止，尚未見關(guān)于吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的殘留檢測(cè)報(bào)道。本試驗(yàn)建立了桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒殘留檢測(cè)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法(UPLC-MS/MS)，以期為桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品和試劑 吡蟲啉和啶蟲脒(Krexiom-methyl)標(biāo)準(zhǔn)品購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所(編號(hào)分別為GSB-1890-2008和SB-108-2008)，甲醇、乙腈，甲苯，甲酸均為色譜級(jí)，購自Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備 超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(Waters，UPLC-TQS)，色譜柱(Waters，Xbridge C18，3.5μm 3.0×50mm)，超純水儀(Millipore，Milli-Q)，旋渦混合器(IKA，Vortex Genius 3)，搖床(IKA，HS501)，離心機(jī)(Sigma，3-18KS)，氮吹儀(Organomation，N-EVAP112)，固相萃取小柱(Agilent，Mega BE CARB/NH2500mg/6mL)，固相萃取裝置(Agilent)，50mL離心管(Eppendorf)以及微孔濾膜(津騰，PTFE 0.22μm)等。

1.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取勻漿后的桑葚樣品10.00g于50mL離心管中，加入20.00 mL乙腈，置于搖床上振搖30min，加入5g氯化鈉，蓋上塞子，劇烈震蕩1min，置于離心機(jī)中10 000r/min離心10min，移取上清液10.00 mL待凈化。

1.4 樣品凈化 將移取的10.00 mL提取液加入已經(jīng)過5 mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)預(yù)淋洗Mega BE CARB/NH2柱，收集淋洗液，再用25mL乙腈+甲苯(3∶1，V/V)分5次洗脫，合并淋洗液，于40℃氮吹吹至近干，用5.00mL 50%甲醇定容，旋渦混合器混勻后過0.22μm濾膜，待檢測(cè)。

1.5 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件 流動(dòng)相采用甲醇，乙腈和含有0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序(表1)，流動(dòng)相使用前用超聲波脫氣。色譜柱溫：35℃，樣品室溫度16℃，進(jìn)樣量：2μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式進(jìn)行采集，相關(guān)參數(shù)(表2)。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件

續(xù)表

表2 測(cè)定吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中殘留的質(zhì)譜參數(shù)

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限 分別取一定量的吡蟲啉和啶蟲脒標(biāo)品溶液用桑葚空白基質(zhì)配制成濃度為0.10、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用1.5儀器條件進(jìn)行分析，以吡蟲啉和啶蟲脒定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸分析求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用Masslynx V4.1軟件繪制。檢測(cè)限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙份樣品進(jìn)行測(cè)定，采用Masslynx V4.1軟件計(jì)算吡蟲啉和啶蟲脒的信噪比(S/N)，以S/N≥3時(shí)的樣品濃度為方法檢測(cè)限[13]。

1.7 回收率 回收率試驗(yàn)采用加標(biāo)回收試驗(yàn)法。

回收率(%)=樣品實(shí)測(cè)濃度/樣品理論濃度×100%。

取桑葚空白樣品，根據(jù)高、中、低3個(gè)濃度分別加入相應(yīng)的吡蟲啉和啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行質(zhì)控樣品。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理，采用1.5儀器條件測(cè)定藥物濃度，根據(jù)隨行測(cè)定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)濃度與樣品理論濃度的百分比。

1.8 精密度 精密度試驗(yàn)采用加入法。取桑葚空白樣品，根據(jù)高、中、低3個(gè)濃度分別加入相應(yīng)的吡蟲啉和啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度水平做6個(gè)平行。所有樣品按1.3和1.4進(jìn)行樣品前處理，采用1.5儀器條件測(cè)定藥物濃度，連續(xù)測(cè)定3d，根據(jù)隨行測(cè)定的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的實(shí)測(cè)濃度，即可求得方法的日內(nèi)和日間精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法選擇性 該試驗(yàn)條件下，吡蟲啉和啶蟲脒采用反相液相色譜分離，流動(dòng)相中加入0.1%體積分?jǐn)?shù)的甲酸來提高ESI+的離子化效率。結(jié)果表明，吡蟲啉和啶蟲脒保留時(shí)間分別為3.69min和3.92min，峰形及分離度良好，且可獲得較強(qiáng)的分子離子峰強(qiáng)度，桑葚基質(zhì)對(duì)桑葚樣品中吡蟲啉和啶蟲脒的測(cè)定無干擾。吡蟲啉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜，桑葚空白樣品圖譜和桑葚加標(biāo)樣品圖譜(圖1、圖2和圖3)，啶蟲脒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜，桑葚空白樣品圖譜和桑葚加標(biāo)樣品圖譜(圖4、圖5和圖6)。

圖1 吡蟲啉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(1.00μg/L)

圖2 桑葚空白樣品圖譜

圖3 桑葚加標(biāo)樣品圖譜(1.00μg/kg)

圖4 啶蟲脒基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液圖譜(1.00μg/L)

圖5 桑葚空白樣品圖譜

圖6 桑葚加標(biāo)樣品圖譜(1.00μg/kg)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限 吡蟲啉和啶蟲脒基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線在質(zhì)量濃度0.10～100.00μg/L時(shí)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為y=1.361 4×104x+6 547(R2=0.999)和y=7.074 2×104x+68 113(R2=0.997)。以3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測(cè)限，吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的方法檢出限(method detection limit，MDL)均為0.02μg/kg。以4倍MDL為測(cè)定下限[11]，即4倍方法檢出限濃度作為測(cè)定下限，則吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的測(cè)定下限為0.10μg/kg。

2.3 回收率 吡蟲啉和啶蟲脒在1.00、10.00和100.00μg/kg 3個(gè)濃度下的桑葚添加樣品回收率分別為106.45%、94.46%、92.54%和90.47%、94.93%、86.88%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在5.00%以內(nèi)，(表3)，表明該試驗(yàn)方法在測(cè)定桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒的殘留時(shí)具有較好的回收率。

表3 桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒回收率(n=6)

2.4 日內(nèi)精密度和日間精密度 該試驗(yàn)條件下，吡蟲啉和啶蟲脒在1.00、10.00和100.00μg/kg 3個(gè)濃度的桑葚添加樣品日內(nèi)精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.68%、3.66%、2.77%和2.52%、3.09%、3.27%，日間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.47%、4.65%、4.01%和3.55%、4.56%、3.98%，(表4)。結(jié)果表明，該試驗(yàn)方法在檢測(cè)桑葚中的吡蟲啉和啶蟲脒時(shí)，具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表4 桑葚中吡蟲啉和啶蟲脒日內(nèi)精密度和日間精密度(n=6)

3 討論

該試驗(yàn)樣品采用乙腈提取，石墨化碳黑氨基復(fù)合柱凈化，超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測(cè)吡蟲啉和啶蟲脒在桑葚中的殘留，該方法前處理過程操作簡(jiǎn)便，方法的選擇性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、回收率和精密度均滿足樣品分析方法要求。該試驗(yàn)采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)校正法來降低和消除基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。