張艷華，包淑云，年四輝，喻麗珍，劉人豪

（皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002）

元胡為罌粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的塊莖，具有行氣止痛、活血散瘀、治療跌打損傷的功效.用于跌打腫痛、崩中、癥瘕、產(chǎn)后血暈、經(jīng)閉痛經(jīng)、惡露不盡等.其在李時(shí)珍的《本草綱目》等本草書(shū)籍中都有記載，是常用中藥，內(nèi)含約30種生物堿，主要是原小檗堿類和阿樸啡類生物堿，包括了延胡索甲素、延胡索乙素、小檗堿、黃連堿、元胡寧等，其中最主要的有效成分是延胡索乙素，2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》對(duì)其質(zhì)量控制要求元胡中延胡索乙素含量不得低于0.04%[1]，因延胡索乙素是叔胺堿，易溶于有機(jī)溶劑，不易溶于水，在對(duì)其進(jìn)行提取時(shí)，一般可利用其脂溶性的特性，直接用有機(jī)溶劑提取，也可以使其由叔胺堿轉(zhuǎn)變成易溶于水的季胺堿后用親水性溶劑提取，而臨床上根據(jù)病癥不同，主要有延胡索生用和用醋炮制后使用兩種方法，用得最多的是醋制品.為了使延胡索中的有效成分被充分利用，提高延胡索乙素的提取率，本實(shí)驗(yàn)采用多種提取方法，以延胡索乙素為指標(biāo)，采用RP-HPLC法測(cè)定不同提取方法中延胡索乙素的含量，比較不同提取方法的提取率，為延胡索被更好的利用提供參考.

1 材料與儀器

1.1 材料

元胡藥材（產(chǎn)地為安徽宣城）購(gòu)自亳州藥材市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為罌粟科植物延胡索 (Corydalis yanhusuo W.T.Wang)的干燥塊莖.延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)110726-201213）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，米醋（江蘇恒順醋業(yè)股份有限公司）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水.

1.2 儀器

日本島津LC-20A高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測(cè)器、LC-20AT真空在線脫氣機(jī)、CTO-10AS柱溫箱、LC-20AT四元泵）、KQ5200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、D2F-6050型真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、JY501型電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、PHS-3C精密PH計(jì)（上海越平科學(xué)儀器有限公司）.

2 方法

2.1 炮制品的制備[2]

取大小均勻的元胡100g，加入純米醋20g拌勻，待醋液吸盡后，燜潤(rùn)，用文火加熱炒干，粉碎，粉末過(guò)3號(hào)篩，備用.

2.2 樣品的提取

2.2.1 連續(xù)回流提取法

取粉末2g,精密稱定，用75%的無(wú)水乙醇250ml提取至完全，抽濾，濾液定容至250ml，取濾液50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.2 常規(guī)水煮法

取粉末2g,精密稱定，置燒杯中，加入蒸餾水250ml，用環(huán)保爐加熱煮沸1.5h后，過(guò)濾，濾渣再加蒸餾水100ml煮沸1h后取出，過(guò)濾，如此反復(fù)至提取完全，合并濾液并定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

1）系統(tǒng)程序設(shè)計(jì)有待優(yōu)化。實(shí)現(xiàn)教改課題項(xiàng)目的信息化管理，最為關(guān)鍵的問(wèn)題是實(shí)現(xiàn)教改項(xiàng)目數(shù)據(jù)的全面采集和挖掘，但教改項(xiàng)目的數(shù)據(jù)很多是以文本、關(guān)鍵詞等為代表的非結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)，雖然系統(tǒng)設(shè)計(jì)時(shí)已經(jīng)完善了項(xiàng)目申報(bào)書(shū)格式內(nèi)容，盡可能采集具有可分析、可統(tǒng)計(jì)的結(jié)構(gòu)化數(shù)據(jù)，但是在試用中發(fā)現(xiàn)，在一些程序設(shè)計(jì)上，如教師的論文發(fā)表情況這個(gè)采集點(diǎn)，系統(tǒng)沒(méi)有進(jìn)行限定性的選擇和引導(dǎo)，導(dǎo)致收集的相關(guān)數(shù)據(jù)格式不一，無(wú)法進(jìn)行有效分析。

2.2.3 溫浸提取法

取粉末2g,精密稱定，置錐形瓶中加入75%的無(wú)水乙醇250ml封口置80℃恒溫水浴鍋中溫浸24h，抽濾，濾液定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.4 微波提取法

取粉末2g,精密稱定，置錐形瓶中加入75%的無(wú)水乙醇250ml,置于微波樣品處理器中提取30min，溫度設(shè)置60℃，功率300W，提取液抽濾，定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.5 滲漉法

取粉末2g，精密稱定，置于滲漉裝置中,加75%無(wú)水乙醇250ml，滲漉30h,抽濾，濾液定容至250ml，取50ml滴加氨水至pH9.0，置真空干燥箱中蒸干，備用.同法平行提取3份.

2.2.6 超聲提取法

2.3 色譜條件

色譜柱為AgilentTC-C18(2)色譜柱（250×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇:0.3%三乙胺（冰醋酸調(diào) pH至 6.5）（55:45），檢測(cè)波長(zhǎng) 280nm，流速1.0ml/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量 20μl.

2.4 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品0.5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含0.05mg的對(duì)照品溶液.

2.5 供試品溶液的制備

將2.2項(xiàng)中制備的各提取物加甲醇溶解并定容至10ml，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

精密吸取延胡索乙素對(duì)照品儲(chǔ)備液，以甲醇配制成 10μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、50μg/ml對(duì)照品溶液，分別吸取20μl注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積.以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程.

2.6.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取延胡索乙素對(duì)照品溶液20μl，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，計(jì)算延胡索乙素峰面積的RSD值.

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0,2,4,8,12和24h進(jìn)樣分析，測(cè)定延胡索乙素的峰面積值，計(jì)算RSD值.

2.6.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取元胡同一份供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行5次平行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定延胡索乙素的含量，計(jì)算RSD值.

2.6.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量的醋炙元胡藥材粉末約0.2g，6份，精密加入延胡索乙素的對(duì)照品貯備液適量，按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率.

2.7 樣品含量測(cè)定

取各提取好的樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液20μl，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算延胡索乙素的含量，各提取方法3份取平均值.

3 結(jié)果與討論

3.1 RP-HPLC色譜圖

對(duì)照品與樣品色譜圖見(jiàn)圖1.

3.2 方法學(xué)考察結(jié)果

3.2.1 線性關(guān)系考察

對(duì)照品濃度與色譜峰面積的線性回歸方程為y=14391x-11523(R2=0.9992)，線性范圍為 10～50μg/ml.

3.2.2 精密度試驗(yàn)

延胡索乙素對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣5次后，色譜峰面積的 RSD（n=5）為 1.28%.

圖1 延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)的RP-HPLC圖

3.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

同一供試品溶液分別在0,2,4,8,12和24h進(jìn)樣分析，色譜峰面積RSD為1.41%.表明該方法有較好的穩(wěn)定性.

3.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

元胡同一供試品溶液進(jìn)樣5次后，延胡索乙素的含量RSD為2.10%，表明樣品測(cè)定重復(fù)性良好.

3.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

加樣回收率實(shí)驗(yàn)延胡索乙素的平均回收率為99.03%，RSD（n=6）為 1.02%.結(jié)果見(jiàn)表 1.

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.3 含量測(cè)定結(jié)果及討論

各樣品延胡索乙素含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2.從結(jié)果中看到，用水作為提取溶劑時(shí),延胡索乙素的溶出量明顯低于用75%的無(wú)水乙醇的溶出量，在同樣用75%的無(wú)水乙醇提取時(shí)，連續(xù)回流提取法和超聲提取法提取率都較高.這是因?yàn)檠雍饕宜厥窃￠迚A類叔胺堿，以游離狀態(tài)存在，易溶于有機(jī)溶劑，不易溶于水，而傳統(tǒng)中藥都是用水煎煮，所以臨床中醫(yī)使用時(shí)都是經(jīng)過(guò)醋制后，使延胡索乙素上的N原子接收質(zhì)子后由叔胺堿轉(zhuǎn)變成季銨鹽，增加水溶性，使其易于煎煮溶出，但從結(jié)果看出，雖然實(shí)驗(yàn)樣品用的是醋制品，但是在水溶液中的提取率還是很低，并不能使延胡索乙素提取完全，所以單純水煎煮對(duì)有效成分的利用率比較低，這也可能是因?yàn)榇字藭r(shí)并沒(méi)有使所有的延胡索乙素從叔胺堿變成季銨堿，所以游離的那部分并不能溶于水，而不管延胡索乙素是游離態(tài)還是成鹽的狀態(tài)，都是可以溶于乙醇的，所以其他的提取方法都比常規(guī)水煮法提取率高.

表2 樣品中延胡索乙素含量

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用不同的提取方法對(duì)延胡索中的延胡索乙素進(jìn)行了提取和含量測(cè)定，除了常規(guī)水煮法，其他方法都是使用相同的溶劑進(jìn)行了提取，從測(cè)定的結(jié)果可以看出，常規(guī)水煮法提取率最低，連續(xù)回流提取法提取率最高，所以，如果不是從中藥方劑中各藥的君臣佐使互相作用水煎煮去使用的話，在元胡提取時(shí)，還是采用連續(xù)回流提取法效果好，使藥物的有效成分能被充分利用.