劉喚明,洪鵬志,*,周春霞,楊 萍,陳康健,吳金紅

(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心,廣東湛江 524088;2.廣東省水產(chǎn)品深加工及副產(chǎn)物高值化利用工程技術(shù)研究中心,湛江恒興水產(chǎn)科技有限公司,廣東湛江 510300)

我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量和加工產(chǎn)量居于世界首位。冷凍羅非魚片是羅非魚加工的主要產(chǎn)品,但在其加工過程中會(huì)產(chǎn)生40%～55% 的下腳料[1-2]。羅非魚下腳料有較高的蛋白質(zhì)含量,且富含必需氨基酸[3],具有較高的利用價(jià)值。然而,目前國內(nèi)絕大多數(shù)羅非魚下腳料被加工成低級(jí)魚粉出售,其價(jià)值并未得到充分利用,因此迫切需要尋找到羅非魚下腳料的高值化利用途徑。水產(chǎn)蛋白水解后可以產(chǎn)生具有抗氧化、抗菌、降血壓和免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能的活性多肽[4],因而制備活性肽是水產(chǎn)蛋白高值化利用的研究熱點(diǎn)。目前,國內(nèi)研究人員對(duì)羅非魚下腳料的酶解工藝進(jìn)行了大量的研究[5-8]。

現(xiàn)在國內(nèi)多采用酶解法來制備水產(chǎn)蛋白多肽,此方法有工藝程序相對(duì)簡單、易操作等,但其成本較高,且對(duì)水產(chǎn)蛋白固有的腥味沒有去除作用。發(fā)酵法不但可利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶來降低活性肽的生產(chǎn)成本,而且還可通過微生物復(fù)雜的生化過程可在一定程度上去除水產(chǎn)蛋白固有的腥味[9],因而,近年來有關(guān)發(fā)酵法制備水產(chǎn)蛋白肽的研究得到了研究人員的關(guān)注[10-14]。

枯草芽孢桿菌是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品菌株,早在一千多年前日本利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)他們的傳統(tǒng)食品——納豆。枯草芽孢桿菌具有豐富的產(chǎn)酶能力,其生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和脂肪酶等廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。目前,研究人員已將枯草芽孢桿菌廣泛地應(yīng)用于發(fā)酵法制備乳蛋白肽[15]、大豆肽[16-17]和膠原蛋白肽[12]等多種蛋白肽。本研究以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株,利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵羅非魚下腳料制備蛋白肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化,以期進(jìn)一步提高羅非魚下腳料蛋白質(zhì)的水解度,為羅非魚蛋白肽的發(fā)酵制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚下腳料 去除羅非魚下腳料中的內(nèi)臟和魚皮,清洗下腳料中保留的魚頭、魚骨及其附著的魚肉,用絞肉機(jī)將清洗干凈的保留物絞碎,絞碎物置于-20 ℃冰箱中凍藏備用,湛江亞洲水產(chǎn)科技有限公司;枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)HL-1 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院海洋生物制品研究團(tuán)隊(duì);LB液體培養(yǎng)基(%):牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，pH7.2 實(shí)驗(yàn)室自制;茚三酮 分析純,汕頭市西隴化工有限公司;甘氨酸 分析純,山東佰仟化工有限公司。

HZQ-F160型恒溫?fù)u床 金壇市萬華實(shí)驗(yàn)儀器廠;YXQ-SG46-280SA型滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;CR22G II型高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;UV-210PC型分光光度計(jì) 上海森超貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羅非魚蛋白肽的制備方法 將Bacillus subtilis HL-1菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,并于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)(15±0.5) h。培養(yǎng)結(jié)束后將培養(yǎng)液用無菌LB液體培養(yǎng)基調(diào)整混合液的OD630至1.01～1.05制備種子液備用。將絞碎后一定質(zhì)量的羅非魚下腳料解凍后放入到250 mL三角瓶中,加入一定的蒸餾水和葡萄糖,并于121 ℃滅菌20 min。冷卻后接入Bacillus subtilis HL-1的種子液,然后將接入種子液的三角瓶置于恒溫振蕩搖床中,一定溫度下,150 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間發(fā)酵結(jié)束后于8000 r/min離心10 min,收集上清液;最后將上清液置于95 ℃保溫5 min進(jìn)行滅酶,得到羅非魚下腳料蛋白肽水溶液。

1.2.2 水解度測(cè)定方法 參考劉喚明等[12]的方法測(cè)定發(fā)酵后羅非魚下腳料蛋白的水解度。

1.2.3 爬坡實(shí)驗(yàn)(Plackett-Burman,PB)設(shè)計(jì) 分別選取羅非魚下腳料添加量、培養(yǎng)基裝載量、葡萄糖添加量、發(fā)酵溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間和接種時(shí)間這7個(gè)因素的高、低2個(gè)水平,采用PB法設(shè)計(jì)7因素2水平的實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。以羅非魚下腳料蛋白的水解度為響應(yīng)值,通過比較各因素的顯著性水平,篩選出對(duì)羅非魚下腳料蛋白的水解度的影響較為顯著的因素。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn) 以羅非魚下腳料蛋白的水解度變大的梯度方向?yàn)榕榔路较?在PB實(shí)驗(yàn)及其分析結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)最陡爬坡實(shí)驗(yàn),選取對(duì)羅非魚下腳料蛋白的水解度的影響較為顯著的因素進(jìn)行梯度設(shè)計(jì),正效應(yīng)的顯著因素其梯度為遞增,負(fù)效應(yīng)的顯著因素其梯度為遞減,具體實(shí)驗(yàn)安排見表5。

1.2.5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的極值點(diǎn)作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的中心點(diǎn),采用Box-Behnke實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),因素和水平見表2。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合響應(yīng)面模型,得到二次多項(xiàng)式,據(jù)此建立水解度與對(duì)其影響較為顯著的因素之間的經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

1.2.6 羅非魚蛋白肽分子量分布的測(cè)定 參照陳星等[18]的方法,采用高效體積排阻色譜法(High Performance Size Exclusion Chromatography,HPSEC)分析經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后制備的羅非魚蛋白肽的分子量分布情況。羅非魚蛋白肽水溶液測(cè)定前過0.22 μm微濾膜。使用色譜柱:TSKgel G2000 SWXL(300 mm×7.8 mm);柱溫:30 ℃,流動(dòng)相:超純水∶乙腈∶三氟乙酸=55∶45∶0.1;流速:0.5 mL/min;測(cè)定紫外檢測(cè)波長:220 nm;進(jìn)樣量:10 μL。分子量標(biāo)準(zhǔn)品為:細(xì)胞色素C(12500 u);抑肽酶(6500 u);桿菌酶(1450 u);乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u);乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(189 u)。根據(jù)出峰時(shí)間和分子量大小的對(duì)數(shù)作分子量標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程為 Lg Mr=-0.231x+7.051(R2=0.995),樣品的分子量根據(jù)其洗脫時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。用Minitab17.0軟件對(duì)PB實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析,用Minitab17.0軟件對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及優(yōu)化

PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3,其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4。由表4結(jié)果可知:羅非魚下腳料添加量、葡萄糖添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)水解度呈正效應(yīng),裝液量、發(fā)酵溫度、接種量和接種時(shí)間對(duì)水解度呈負(fù)效應(yīng);其中裝液量、發(fā)酵溫度和羅非魚下腳料添加量羅非魚下腳料添加量對(duì)水解度的影響均顯著(p<0.05)。因此選擇裝液量、發(fā)酵溫度和羅非魚下腳料添加量羅非魚下腳料添加量這3個(gè)因素作為主要影響因素進(jìn)行最陡爬坡實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Plackett-Burman design and results

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4結(jié)果可知,羅非魚下腳料添加量是正效應(yīng),所以在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中它的變化方向是遞增的;而裝液量和發(fā)酵溫度是負(fù)效應(yīng),因而在最陡爬坡實(shí)驗(yàn)中它們的變化方向是遞減的。由表5結(jié)果可知,水解度在第3組達(dá)到最大值,因而以羅非魚下腳料添加量羅非魚下腳料添加量為12%、裝載量為40 mL/250 mL和發(fā)酵溫度為33 ℃作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)水解度影響的統(tǒng)計(jì)Table 4 Statistical analysis of the Plackett-Burman experiment results on degree of hydrolysis

表5 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝

表6 Box-Behnke實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 6 Experimental design and results of Box-Behnken experiment

表7 回歸方程的方差分析表Table 7 Variance analysis for regression equation

2.3.2 響應(yīng)面分析和最佳發(fā)酵工藝確定 羅非魚下腳料添加量與裝載量、羅非魚下腳料添加量與發(fā)酵溫度、裝載量與發(fā)酵溫度之間的交互作用如圖1所示。從圖1可以看出響應(yīng)面都為開口向下的凸形曲面,說明實(shí)驗(yàn)存在水解度的最大值。裝載量與羅非魚下腳料添加量的響應(yīng)面圖和發(fā)酵溫度與羅非魚下腳料添加量的響應(yīng)面圖都比較陡峭,且它們的等高線呈橢圓,這說明它們的交互作用比較顯著,這與表7的回歸分析結(jié)果一致。運(yùn)用Minitab17.0軟件對(duì)上面二次回歸方程中的響應(yīng)值求最大值,得出極值點(diǎn)為X1=0.899、X2=0.859、X3=0.677,并由計(jì)算得出相應(yīng)的羅非魚下腳料添加量為13.8%、裝載量為48.6 mL/250 mL、發(fā)酵溫度為34.4 ℃,預(yù)測(cè)的水解度最大值為33.26%。

圖1 兩因素間交互作用對(duì)水解度影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots showing the interaction of parameters on the degree of hydrolysis

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)值的準(zhǔn)確性,依照上面響應(yīng)面分析得到的最佳發(fā)酵工藝,并結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作的可行性,選取羅非魚下腳料添加量為13.8%、裝載量為48.6 mL/250 mL、發(fā)酵溫度為34 ℃。并在上述工藝下做了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測(cè)定水解度的結(jié)果分別為33.15%、33.02%和33.20%,平均值為33.12%,與預(yù)測(cè)值(33.26%)基本一致,說明該模型可較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

2.4 羅非魚蛋白肽的分子量分布情況

經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后制備的羅非魚蛋白肽的分子量分布情況用高效體積排阻色譜法分析測(cè)定。由圖2結(jié)果可知,羅非魚蛋白肽的出峰時(shí)間集中在15～25 min之間。由表8結(jié)果可知,羅非魚蛋白肽的分子量都在5000 u以下,且分子量在231～637 u蛋白肽所占的比例為74.058%。根據(jù)海洋魚低聚肽粉的國家標(biāo)準(zhǔn)[19],分子量在1000 u以下的為低聚肽。因而本研究制備的羅非魚蛋白肽中低聚肽含量達(dá)74.058%。

圖2 羅非魚蛋白肽的HPSEC圖譜Fig.2 HPSEC chromatogram of peptide from tilapia scraps

表8 羅非魚蛋白肽的分子量分布Table 8 Molecular weight distribution of the peptide from tilapia scraps

3 結(jié)論

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌HL-1為發(fā)酵菌株,采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)酵羅非魚下腳料制備蛋白肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。首先通過Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出影響水解度的顯著因素:羅非魚下腳料添加量、裝液量和發(fā)酵溫度。接著通過最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大水解度區(qū)域。最后利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析,確定最佳發(fā)酵工藝為:羅非魚下腳料13.8%、發(fā)酵溫度為34 ℃、裝載量為48.6 mL/250 mL。優(yōu)化后羅非魚下腳料中蛋白質(zhì)的水解度高達(dá)33.12%,制備的羅非魚蛋白肽中低聚肽含量高達(dá)74.058%。