陳少敏,朱涵予,劉冬梅,許丹云,馬愛民

(華中農業(yè)大學食品科學技術學院,湖北武漢 430070)

疏水蛋白(Hydrophobins)是目前已知的一類表面活性極強的小分子量兩性蛋白,約含有100個氨基酸,分子量約為10 kDa,廣泛存在于各種絲狀真菌中。根據(jù)氨基酸排列方式和性質的不同,疏水蛋白分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種[1]。I型疏水蛋白自我裝配形成的蛋白膜具有高度的不溶解性,即使在100 ℃水浴時也難溶解于2% SDS,只有在強酸如甲酸和三氟乙酸中才可以被解離[2-3]。疏水蛋白一個非常重要的特性就是當它們遇到親水―疏水界面時就會發(fā)生自組裝,形成一層兩親性的薄膜,厚度約為10 nm,性質十分穩(wěn)定,且能改變界面的親水性和疏水性[4-5]。因此,疏水蛋白在食品、醫(yī)學、工業(yè)等領域具有強大的應用前景,如疏水蛋白的乳化性可以作為許多食品的穩(wěn)定劑、疏水性可用于食品的保鮮[6-7]以及用作生物材料[8-9]、疏水蛋白SC3在小鼠模型也表現(xiàn)出較強的抗腫瘤作用[10]。

銀耳(Tremellafuciformis),又稱白木耳、雪耳等,在分類學上隸屬于真菌門,擔子菌綱,異隔擔子菌亞綱,銀耳目,銀耳科,銀耳屬[11]。銀耳被譽為“菌中之冠”,是一種珍貴的食用藥用兩用菌。銀耳能產生酵母狀的單核體芽孢,是一種良好的生物反應器[12-13]。

本實驗室前期從平菇菌絲中克隆到Ⅰ型疏水蛋白基因Po.hyd[14],并在銀耳芽孢中成功實現(xiàn)了異源表達[15]。為進一步改善疏水蛋白的性質,充分利用疏水蛋白的潛在應用和銀耳的可食性優(yōu)勢,本實驗試圖用分子生物學的方法對疏水蛋白進行改造,將平菇疏水蛋白基因hyd與去除終止密碼子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并導入到銀耳芽孢中表達,希望改善疏水蛋白的性質,同時也為其他蛋白質的改性研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀耳芽孢32Y、平菇菌絲P739、根癌農桿菌EHA105 本實驗室保存;質粒pEGH 由本實驗室朱涵予改造pCAMBIA1302質粒并保存[16];大腸桿菌DH5α、pMD18-T克隆載體、限制性內切酶SacⅠ、MluⅠ、BamHⅠ、AsuⅡ、XhoⅠ 大連TaKaRa;T4 DNA Ligase 美國Promega;凝膠純化試劑盒、回收試劑盒和質粒提取試劑盒 美國Axygen;Southern雜交試劑盒 美國GE;PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基;YEB培基、IM培養(yǎng)基、Co-CM培養(yǎng)基、三氟乙酸(Trifluoroacetic acid,TFA) Sigma公司;低分子量蛋白標準 TaKaRa公司;其他試劑 均為分析純。

PCR儀 美國Bio-Rad公司;冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 PDA培養(yǎng)基:稱取46 g PDA粉末,用蒸餾水定容至1 L,添加1.5% 瓊脂粉,121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

YEB培養(yǎng)基:蛋白胨5 g/L,酵母提取物1 g/L,營養(yǎng)肉湯5 g/L,蔗糖5 g/L,七水硫酸鎂0.5 g/L,NaOH調節(jié)pH至7.2,用蒸餾水定容至1 L,添加1.5%瓊脂粉,121 ℃,30 min高溫高壓滅菌。

MM培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,硫酸銨1.32 g(含N 20 mmoL/L),MgSO4·7H2O 0.25 g,kH2PO4·3H2O 0.5 g,VB1 0.2 mg,ZnSO4·7H2O 2 mg,CaCl2·2H2O 0.5 g,鉬酸銨 0.02 mg,補足ddH2O定容至1 L,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

IM培養(yǎng)基:20×磷酸緩沖溶液5 mL,20×鹽溶液5 mL,50% 甘油1 mL,1 mol/L葡萄糖溶液1 mL,1 mol/L MES溶液4 mL,200 mmol/L AS溶液0.1 mL,補足ddH2O定容至100 mL。

Co-CM培養(yǎng)基:20×磷酸緩沖溶液5 mL,20×鹽溶液5 mL,50%甘油1 mL,1 mol/L葡萄糖溶液0.5 mL,1 mol/L MES溶液4 mL,200 mmol/L AS溶液0.1 mL,補足ddH2O定容至100 mL。

1.2.2 基因的克隆及載體的構建 根據(jù)NCBI上發(fā)表的Po.hyd(GenBank登錄號為No.AF331452.1),利用軟件Primer 5.0進行引物設計,如表1所示。

表1 所用引物序列Table 1 Primers used in this study

收集PDA平板上P739平菇菌絲并提取總RNA。以提取的RNA為模板,用Ancheored Oligo(dT)18體系反轉錄RNA得到cDNA(具體操作步驟參照TransScript?One-Stepg DNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix說明書)。以cDNA為模板,H1-F/R和H2-F/R引物,分別擴增平菇疏水蛋白基因hyd與去除終止密碼子的hyd。擴增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循環(huán)數(shù)為34個,72 ℃ 7 min。分別用BamHⅠ、AsuⅡ和MluⅠ、BamHⅠ雙酶切PCR純化產物,并用Mlu Ⅰ、Asu Ⅱ雙酶切pGEH質粒,膠回收雙酶切的產物,并通過酶連反應構建H-H的表達載體pEGH-H-H。將pEGH-H-H轉化DH5α大腸感受態(tài),用H1-F/R引物進行菌落PCR驗證,并對菌落質粒進行Mlu Ⅰ、Asu Ⅱ雙酶切驗證。pEGH-H-H載體圖如圖1所示。提取陽性轉化子的質粒,將其電擊轉化A.tumefaciensEHA105,用H1-F/R引物進行菌落PCR檢測。

圖1 pEGH-H-H載體圖Fig.1 pEGH-H-H vector

1.2.3 轉化子的篩選及鑒定 通過根癌農桿菌介導轉化方法將pEGH-H-H載體質粒導入到銀耳的基因組中[17]。將含有pEGH-H-H的根瘤農桿菌接種到含50 μg/mL 卡那和50 μg/mL利福平的YEB,28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,吸取120 μL菌液,接種到12 mL上述液體培養(yǎng)基中,28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6～0.8,4 ℃ 5000 r/min離心10 min,棄濾液,用新鮮配制的含有200 μmol/L AS的IM培養(yǎng)基重懸菌體至OD600值約為0.1～0.15,于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)誘導根癌農桿菌毒性,直至菌懸液OD600值為0.6。將銀耳芽孢接種于液體MM培養(yǎng)基中7 d,用IM培養(yǎng)基調節(jié)孢子濃度為106個/mL。將已誘導根瘤農桿菌菌懸液與銀耳芽孢懸液混合后,涂布于鋪有無菌濾膜的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)3 d,將濾膜轉接到含有50 μg/mL潮霉素和200 μg/mL頭孢平板上篩選轉化子,連續(xù)篩選3代。將所獲得的轉化子于無抗PDA培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)7 d,提取DNA,并用H1-F/R和EH-F/R檢測。

擴大培養(yǎng)擬轉化子,提取其基因組DNA經XhoⅠ酶切過夜,以hyd基因作為雜交探針進行Southern blot檢測[18]。并提取陽性轉化子和野生型銀耳32Y的mRNA交由武漢巴菲爾生物技術服務有限公司進行實時熒光定量PCR分析,檢測引物如表1所示。

1.2.4 目標蛋白的提取 按照馬愛民等[19]報道的方法提取目標蛋白。將擬轉化子接種于PDA培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)20 d后冷凍干燥,并以野生型平菇P739菌絲作為對照組,按照料液比1∶10 (m/v)溶解于抽提液I(2% SDS,0.05 mol/L Tris pH6.8)中,100 ℃保持10 min,4000 r/min 離心15 min。所得沉淀溶解于抽提液II(氯仿∶甲酵=2∶1),65 ℃保持10 min,并過濾收集沉淀。向沉淀中加入三氟乙酸溶解,置于冰上放置6 h。所得的樣品經十二烷基磺酸鈉―聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,并采用硝酸銀染色檢測[20]。

1.2.5 疏水蛋白的起泡性和乳化性分析 將銀耳芽孢轉化子5號以及平菇P739的疏水蛋白配制成終濃度為50 μg/mL的樣品,分別取600 μL蛋白溶液,用振蕩混勻儀處理30 s,并在1、3 h 和7 d后取樣進行起泡性和乳化性分析[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗做平行實驗三次，數(shù)值取平均值表示。數(shù)據(jù)采用Oligo 8.0軟件處理。

2 結果分析

2.1 基因的克隆與序列分析

平菇菌絲總RNA的電泳膠圖如圖2A所示,條帶亮度比表明RNA比較完整,符合要求。疏水蛋白cDNA序列擴增結果如圖2B所示,條帶大小符合預期且無雜帶,結合測序結果表明成功擴增平菇疏水蛋白的兩個片段。

圖2 平菇總RNA與PCR擴增產物 Fig.2 Total RNA of P. ostreatus and PCR products 注:A:平菇菌絲總RNA;B:平菇疏水蛋白基因兩個片段PCR結果,其中1泳道為去除TAA的hyd基因,2泳道為完整的hyd基因;M:Trans 2K DNA marker。

2.2 表達載體pEGH-H-H的構建

將雙酶切產物和pEGH進行連接,轉化,用H2-F/R進行菌落PCR檢測,如圖3A所示,在330 bp和660 bp的位置都有帶,分別為單一的疏水蛋白基因和融合疏水蛋白基因,與預期相符。對pEGH-H-H進行MluⅠ、AsuⅡ雙酶切,如圖3B所示,在大約660 bp處有一條明顯的帶,結果表明,pEGH-H-H載體構建成功。

提取pEGH-H-H質粒,并電轉化到根癌農桿菌EHA105,H2-F/R引物進行菌落PCR檢測,如圖3C所示,在330 bp和660 bp的位置分別有條帶,說明pEGH-H-H質粒成功導入根癌農桿菌EHA105中。

圖3 菌落PCR與pEGH-H-H質粒雙酶切驗證結果Fig.3 Colony PCR and digestion of pEGH-H-H plasmid注:M:Trans 2K DNA marker;A:泳道1、2 為隨機挑取含pEGH-H-H質粒的大腸桿菌單菌落PCR結果;B:泳道1、2為隨機挑取2個含pEGH-H-H大腸桿菌的質粒雙酶切結果 C:泳道1～4為隨機挑取4個含pEGH-H-H質粒的根瘤農桿菌菌落PCR結果。

2.3 轉化子的PCR篩選及驗證

通過根癌農桿菌介導轉化將pEGH-H-H載體質粒導入到銀耳的基因組中。在潮霉素平板上隨機挑芽孢轉化子,以擬轉化子的DNA作模板,分別用EH-F/R和H2-F/R引物進行PCR檢測,結果如圖4所示。其中EH-F/R引物擴增的帶大小約為550 bp,H2-F/R在330 bp,660 bp左右都有帶,結果與預期相符,表明融合疏水蛋白成功導入到銀耳芽孢中。

圖4 轉化子PCR驗證結果Fig.4 Transformant verification by colony PCR注:A:EH-F/R引物PCR擴增結果,其中泳道1～5為轉化子;B:H2-F/R引物PCR擴增結果,其中泳道1為野生型32Y,泳道2～6為擬轉化子;M:Trans 2K DNA marker。

2.4 轉化子Southern blot分析

選取10個轉化子作Southern blot分析,結果如圖5所示。5號芽孢為三拷貝,8號為雙拷貝轉化子,而1、2、10號為單拷貝轉化子,3、4、6、7、9號轉化子未獲得雜交信號,可能為假陽性,也有可能是在第3～5代傳代接種的過程中,部分轉化子多次傳代后出現(xiàn)了抗性基因丟失,有研究表明內源強啟動子有助于維持轉化子遺傳性狀的穩(wěn)定表達[22]。

圖5 轉化子Southern雜交結果Fig.5 Southern blot analysis of transformants 注:M:λ DNA/HindⅢ marker,CK1為陰性對照32Y芽孢,CK2為陽性對照載體質粒,1～10分別1～10號轉化子。

2.5 轉化子real-time PCR分析

選取32Y野生型芽孢和1、5、8、10 號轉化子芽孢進行Real-time PCR分析,結果如圖6所示。其中1、8、5號均有表達,8號和5號表達量較高,分別為野生型對照組的5.071倍、11.406倍,結果與Southern blot分析結果一致,而1號可能為假陽性轉化子或單拷貝。

圖6 野生型及轉化子的實時定量檢測結果Fig.6 Real-time PCR of the wild-type and transformants注:32Y為野生型銀耳芽孢;1、5、8、10為轉化子。

2.6 目標蛋白的提取及電泳檢測

選取5號轉化子擴大培養(yǎng),以P739平菇菌絲為對照組,利用三氟乙酸法提取目標蛋白,SDS-PAGE檢測,如圖7所示。從圖中能明顯看出5號轉化子能提取出目標蛋白(箭頭所指),此蛋白的大小與野生型平菇菌絲中的疏水蛋白有明顯差異,約為P739平菇菌絲疏水蛋白的二聚體大小類似,表明平菇融合蛋白在銀耳芽孢中成功表達。

圖7 純化融合蛋白的SDS-PAGE電泳結果Fig.7 SDS-PAGE result of the purified fusion protein注:M為蛋白質分子量marker;泳道1為平菇P739菌絲;泳道2為5號轉化子。

2.7 起泡性和乳化性分析

使用振蕩混勻儀處理終濃度為50 μg/mL的平菇P739疏水蛋白溶液和銀耳芽孢5號轉化子的融合疏水蛋白溶液,如表2所示,5號轉化子的蛋白溶液泡沫明顯高于平菇P739的蛋白溶液泡沫,且在一周后泡沫仍然保持一定高度。從表3可知,5號轉化子蛋白溶液的乳化指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)均高于SDS。由此可見,5號轉化子疏水蛋白溶液的性質比平菇的疏水蛋白溶液有一定程度的提升。

表2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性Table 2 Foamability and foam stability

表3 乳化性及乳化穩(wěn)定性Table 3 Emulsibility and emulsion stability

3 結論

本研究通過雙酶切酶連方法,構建融合疏水蛋白基因H-H,并利用根癌農桿菌介導轉化方法將其成功導入到銀耳芽孢中。Southern雜交驗證發(fā)現(xiàn),轉化子中存在單拷貝、雙拷貝和多拷貝等不同的插入情況。實時熒光定量PCR顯示,高拷貝轉化子中的疏水蛋白相對含量要比單拷貝高,該結果與Southern雜交結果一致。

5號轉化子疏水蛋白的相對表達量最高,為野生型的11.4倍。蛋白溶液起泡性和乳化性比較發(fā)現(xiàn),5號轉化子融合疏水蛋白的性質稍優(yōu)于平菇疏水蛋白,其原因可能與融合疏水蛋白中二硫鍵的數(shù)量較平菇疏水蛋白提高有關。