姚 惠,趙 彬,崔潔媚,段玉清,張海暉,張 迪,蔡梅紅

(江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

植物酚類化合物是高等植物的一種次級代謝產物,是植物化學物質的主要組分之一[1],廣泛分布于蔬菜、水果、香辛料、谷物、豆類和果仁等各種高等植物器官中,主要分為植物黃酮類、植物酚酸類和植物單寧類這3大類[2]。近年研究表明,植物酚類化合物具有抗氧化、調節(jié)免疫、延緩衰老、抗輻射等多種生物活性[3-5],且具有一定的抗癌作用[6-8],并因同時具有天然、高效、毒性低等特點而備受消費者青睞。全谷物食品被認為是谷物在加工過程中僅僅去掉谷物最外面的谷殼,保留下完整的胚芽與糊粉層的谷物食品。近年來全谷物食品越來越受到人們的歡迎,食用全谷物食品有良好的保健作用。全谷物中含有酚類化合物、植酸、維生素等在內的豐富生物活性成分,比其他谷物具有更高的營養(yǎng)價值。谷物種類是影響谷物中酚類化合物含量的主要因素之一,不同種類谷物中的酚類化合物含量相差較大[9-12]。

基于此,本文以4種常見的全谷物蕎麥、大麥、小麥、水稻為原料,通過初步分離和純化,明確其總酚(The total phenolic contents,TPC)和總黃酮含量(The total flavonoid contents,TFC),利用HPLC-MS初步鑒定了4種谷物中酚類化合物的組成。在此基礎上,初步研究4種谷物中酚類化合物的組成、抗氧化性和抗癌細胞增殖活性,并探討其酚類物質含量與抗氧化活性和抗癌細胞增殖活性之間的相關性,為谷物酚類物質的進一步研究提供一定理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕎麥、大麥、小麥、水稻 鎮(zhèn)江市場(同年收獲);結腸癌細胞Caco-2細胞 上海細胞庫;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶 美國Gibco公司;四甲基偶氮唑鹽試劑(MTT)、DPPH試劑,二甲基亞砜(DMSO) 美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、非必需氨基酸(Nonessential Amino Acid,NEAA) Hyclone公司;甲醇(HPLC級) 美國TEDIA公司;沒食子酸(≥99.8%) 中國食品藥品鑒定研究院;其他常用試劑略。

BS224S型電子精密分析天平 Sartorious Germany公司;ALPHAI-4/2-4型冷凍干燥機 德國CHRIST公司;DL-5C型離心機 上海安亭有限公司;HERAcell240i CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司;Tecan Infinite PROTWIN200型多功能酶標儀 瑞士帝肯公司;ThermoLXQ型高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Thermo公司;ZORBAX SB-C18液相色譜柱(250 mm×4.6 μm) 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酚類化合物的提取和純化 將4種谷物脫去谷殼,粉碎機粉碎,過60目篩,用石油醚對粉末脫脂,過濾,收集殘渣后置于-20 ℃冷藏。分別稱取各樣品粉末50 g,與70%(v/v)乙醇混合,料液比為1∶15 (g∶mL),于45 ℃條件下浸提,浸提液過濾,收集上清液,殘渣按照上述方法重復浸提2次[13]。合并2次浸提液,于45 ℃下減壓濃縮至無醇后,以5倍柱體積的浸提液進行上樣(流速為2 mL/min),經AB-8大孔吸附樹脂分離/富集,以體積70%乙醇水洗脫(洗脫流速為2 mL/min),收集乙醇洗脫液,45 ℃下減壓濃縮,經-70 ℃冷凍干燥得到酚類化合物粉末,于-20 ℃密封保存,備用。

1.2.2 TPC的測定 采用Folin-clocalteau[14-15]法,略有改動。標準曲線的測定:以沒食子酸為標準品。將沒食子酸標準溶液梯度稀釋為18.75、37.5、75、150、300 μg/mL。取1 mL標準溶液與4.0 mL Folin試劑(10倍稀釋)混合,再加入5.0 mL7.5%的Na2CO3溶液,25 ℃水浴2 h,于765 nm處測定其OD值(水和試劑的混合物作為空白),并繪制標準曲線,標準曲線方程為:y=0.00825x+0.02047(R2=0.9983)。樣品測定:不同種類谷物酚類提取物樣品按照上述方法測定其OD值,樣品TPC用沒食子酸當量[GAE mg/100 g干重(dw)]表示。

1.2.4 4種谷物酚類物質組成的HPLC-MS分析 采用高效液相質譜聯(lián)用測定谷物中酚類物質的組成,結合文獻[17-19]進行測定,色譜條件為:液相色譜柱為ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 μm);流動相由含有1.0%(v/v)冰乙酸的超純水(A)和甲醇(B)組成。洗脫梯度:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%-50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70～95% B。流速為1.0 mL/min,進樣量為10 μL,檢測波長為280 nm。

質譜條件為:ESI離子源負離子檢測模式,離子源正離子檢測模式1.8 kV,使用氮氣作為干燥和霧化氣體,流速為1.0 mL/min,進樣量為10 μL,掃描波長為50～2000 m/z。

1.2.5 還原能力的測定 采用文獻[20-21],略有改動。將一定質量的谷物提取物粉末溶解后配制成適當濃度的樣品溶液。將1.0 mL樣品溶液與2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)及2.5 mL 10%的三氯乙酸,充分混合后在3000 r/min的條件下離心10 min,吸取2.5 mL的上清液,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,充分混合后于700 nm處測定其OD值。以抗壞血酸(VC)作為陽性對照。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定 采用文獻[22-24],略有改動。取一定質量不同種類谷物提取物粉末溶解后配制適當濃度的樣品溶液。取2.0 mL 0.25 mmol的DPPH·溶液與2.0 mL的樣品溶液充分混勻,避光放置30 min,測定517 nm處OD值(以2.0 mL DPPH·溶液和2.0 mL蒸餾水的混合物作為空白對照)。以VC作為陽性對照。對DPPH·清除率計算公式如下:

式中:A0為2.0 mL DPPH·+2.0 mL無水乙醇的OD值;Ai為2.0 mL DPPH·+2.0 mL樣品溶液的OD值;Aj為2.0 mL無水乙醇+2.0 mL樣品溶液的OD值。

1.2.7 對結腸癌Caco-2細胞增殖的影響 采用MTT分析法檢測4種谷物對Caco-2細胞增殖能力[25-26]。取對數期的Caco-2細胞經胰蛋白酶消化后,以2.0×104個細胞/孔的密度接種在96孔板中,孵育24 h后,經100 μL不同濃度的樣品(0～100 μg/mL,用生長培養(yǎng)基稀釋制備)37 ℃下處理72 h。處理結束后吸除舊的培養(yǎng)基,加入100 μL 1.0 mg/mL 的MTT溶液,37 ℃下孵育4 h,孵育完后加入150 μL的DMSO,使用多功能酶標儀測定490 nm處其OD值。按照下列公式計算增殖抑制率:

式中:At為樣品組OD值;Ac為對照組OD值。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 4種谷物酚類提取物中TPC及TFC的含量

4種谷物純化后TPC和TFC含量如表1所示。由表中可知,不同谷物中TPC和TFC含量之間均存在顯著差異(p<0.05)。其中TPC含量在63.37～465.66 GAE mg/100 g dw之間,而TFC 含量介于58.79～930.42 RTE mg/100 g dw之間。TPC和TFC含量從高到低均依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。其中蕎麥的TPC和TFC含量均顯著高于其他三種谷物提取物(p<0.05),大麥和水稻的TPC和TFC含量之間均無顯著差異,而小麥的TPC和TFC均最低。

表1 4種谷物酚類提取物中總酚和總黃酮含量Table 1 Total polyphenol and flavnoid contents of four grian extracts

2.2 4種典型谷物中酚類化合物組成的初步鑒定

2.2.1 HPLC分析 圖1為4種谷物酚類化合物的HPLC圖,從圖可見在本分析條件下4種谷物酚類化合物均能很好的分離。

圖1 四種谷物的HPLC圖Fig.1 Chromatogram of four grain extracts注:A.蕎麥;B. 大麥;C. 水稻;D.小麥。

2.2.2 酚類化合物的MS分析 基于其保留時間和MS數據并結合參考文獻[19],從蕎麥中成功鑒定出15種酚類化合物,見表2。蕎麥中的酚類化合物主要為黃酮類化合物及其衍生物。其中,A2,A3,A4,A5,A7,A8,A9和A11被鑒定為黃烷-3-醇類。黃烷-3-醇(flavan-3-ol)屬于黃烷醇類化合物,主要包括兒茶素、表兒茶素及其衍生物,是黃酮類化合物中非常重要的一類物質。A12和A13的[M-H]-和MS2均相同,但是保留時間不同,這說明兩者屬于同分異構體。大麥、小麥和水稻中的酚類化合物明顯少于蕎麥?；谄浔Ａ魰r間和MS數據并結合參考文獻[19],在大麥、小麥、水稻提取物中分別成功鑒定出5、3、4種酚類化合物,見表2。

表2 4種谷物提取物中酚類化合物的HPLC-MS分析Table 2 Identification of phenolic compounds of buckwheat

從表2中可見,3種谷物中均含有黃烷-3-醇類化合物(B2、B4、C1、C2、D1)。而大麥和小麥都屬于麥類,均含有芹菜素的衍生物(B3、D2、D3),其中D2和D3的[M-H]-和MS2相同,而保留時間不同,屬于同分異構體。

2.3 四種谷物酚類提取物的抗氧化性

由于化學分析法檢測抗氧化能力的局限性,一般使用兩種或兩種以上具有不同氧化機制的檢測方法分析抗氧化能力。

2.3.1 還原能力分析 通過測定在4種谷物酚類提取物存在下,Fe3+轉化為Fe2+的情況判定其還原能力。由圖2能夠看出,4種谷物酚類提取物均具有一定還原能力,且存在劑量依賴效應。同時,我們還發(fā)現不同種類的谷物之間,還原能力有著顯著差異(p<0.05)。蕎麥的還原能力高于VC,當樣品濃度為200 μg/mL時,OD700值為0.897。而小麥的還原能力最弱,樣品濃度為200 μg/mL,OD700值僅為0.582。綜上,四種谷物酚類提取物的還原能力強弱依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。

圖2 4種谷物酚類提取物還原能力Fig.2 Reducing power of four grain extracts

2.3.2 DPPH自由基清除能力 DPPH·比較穩(wěn)定,可以長時間保存,廣泛應用于測定抗氧化劑的自由基清除能力,從而判斷其抗氧化活性。由圖3能夠發(fā)現,四種谷物酚類提取物均具有一定的DPPH·清除能力,DPPH·清除率隨著樣品濃度的增加前期顯著增加,而后清除率逐步趨于穩(wěn)定。同時,我們還發(fā)現不同種類的谷物之間,DPPH·清除能力有著顯著差異(p<0.05)。其中,蕎麥的DPPH·清除能力最高,200 μg/mL時,蕎麥的DPPH·清除率達到86.10%(同濃度VC的清除率為91.00%)。而小麥對DPPH·清除能力最弱,200 μg/mL時,清除率僅為39.21%。綜上,四種谷物酚類提取物的DPPH·清除能力強弱順序依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。

圖3 4種谷物酚類提取物的DPPH·清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of four grain extracts

2.3.3 4種谷物酚類提取物對Caco-2細胞增殖的抑制作用 在活細胞中,MTT與細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶作用被還原成深紫色結晶物甲臜,并堆積在細胞中,含量與活細胞的數目成正比,但是在死細胞中不能產生發(fā)生這種反應。從圖4可以看出,4種谷物酚類提取物均具有一定的抗Caco-2細胞增殖的能力,且存在劑量依賴效應。其中,蕎麥對Caco-2細胞增殖的抑制能力最強,當樣品濃度為100 μg/mL時,抑制率可達55.62%。這4種谷物在低濃度(20～40 μg/mL)時抗Caco-2細胞增殖活性較弱,在高濃度(100 μg/mL)時,4種谷物酚類提取物的抗Caco-2細胞增殖活力大小依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。

圖4 4種谷物酚類提取物抗Caco-2細胞增殖能力Fig.4 Inhibition effects of four grain extracts on Caco-2 cells proliferation

2.4 4種谷物酚類物質與抗氧化和抗癌細胞增殖活性的相關性

由表3能夠看出,TPC和TFC與抗氧化、抗癌細胞增殖之間存在一定的相關性。總酚含量和總黃酮含量與還原能力之間的相關性良好,分別達到0.933,0.960,酚類化合物與DPPH·清除能力之間也具有一定的相關性。同時,抗氧化活性與抗癌細胞增殖能力之間也具有較強的相關性(與DPPH·清除能力 r=0.987,與還原能力r=0.925),其中抗癌細胞增殖活性與DPPH·清除能力之間的相關性系數存在顯著性關系(p<0.05)。

表3 谷物酚類提取物中總酚和總黃酮含量與其抗氧化和抗癌細胞增殖能力的相關性分析Table 3 Correlation analysis of total phenolic contents,flavnoid contents,antioxidant activity and anti-cancer activity

3 結論

4種谷物后酚類化合物(TPC和TFC)的含量從高到低的順序依次為:蕎麥>大麥>水稻>小麥。從4種谷物中確定了21種酚類化合物,其中蕎麥中酚類化合物種類較多。4種谷物酚類化合物均具有一定的抗氧化和抗Caco-2細胞增殖活性的能力,而且存在劑量依賴關系;其酚類化合物的含量與其抗氧化活性和抗Caco-2細胞增殖活性之間以及抗氧化活性與抗Caco-2細胞增殖活性之間均具有較好的相關性。

植物酚類化合物具有多種生理活性,如抗過敏、抗炎、抑制微生物、抗氧化、抗腫瘤等作用,并且具有天然、高效、低毒等優(yōu)點。因此,植物酚類化合物在食品、藥品、化妝品行業(yè)具有廣闊的發(fā)展前景。谷物是東方人膳食結構中的重要組成部分,且酚類物質含量豐富。然而,目前國內外有關植物酚類化合物的研究多集中于果蔬和茶葉方面,有關谷物酚類化合物及其生理活性方面(特別是抗癌能力方面)的研究相對較少,本文正是基于這種背景下對4種典型谷物中的酚類化合物進行了研究,為谷物酚類化合物的深入研究提供參考。