張朝陽,陳小娥,2,*,夏朝盛,馬聞曜,陳柔含,郭 健,余 輝,2,員立萍

(1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院,浙江舟山 316022;2.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316022;3.陜西好時(shí)鮮海洋生物科技有限公司,陜西西安 710000)

烏賊是我國主要的頭足類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一,其后腹側(cè)直腸末端形成了發(fā)達(dá)的墨囊結(jié)構(gòu),內(nèi)含大量烏賊墨。我國對(duì)烏賊墨的應(yīng)用有著悠久的歷史,很早就將其作為一種藥材。近些年研究發(fā)現(xiàn),烏賊墨是一種粘稠的混懸液,其主要活性成分為真黑色素和蛋白多糖復(fù)合體[1],有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、緩解臟器損傷[4]、抗菌[5]、免疫[6]、促進(jìn)造血[7]等活性功能,但是在水產(chǎn)加工業(yè)發(fā)展的過程中,烏賊墨墨囊常以下腳料的形式丟棄,因而造成了資源的浪費(fèi)。

我國鉛超標(biāo)問題較嚴(yán)重,大多來自工業(yè)污染,群體鉛中毒事件時(shí)有發(fā)生[8],并且鉛會(huì)損害多種細(xì)胞、組織和器官的相關(guān)功能[9],對(duì)機(jī)體的損害是全身性的[10]。有研究表明,烏賊墨中含有的黑色素是以吲哚結(jié)構(gòu)為主體的異聚物[11],其結(jié)構(gòu)中存在可與金屬鍵結(jié)合的基團(tuán)[12],可作為自由基的接受體而阻斷自由基連鎖反應(yīng)[13],從而具有吸附鉛等重金屬離子的特性。

目前,國內(nèi)已有學(xué)者對(duì)提取烏賊墨黑色素工藝進(jìn)行了研究,主要有:高速離心水洗法[14]、濃鹽酸酸洗法[15]和酶解法[16]。關(guān)于烏賊墨黑色素對(duì)鉛的吸附作用,為了研究這3種方法所制備的烏賊墨黑色素對(duì)吸附鉛性能的影響,以鉛吸附量為指標(biāo),確定黑色素制備方法。在此基礎(chǔ)上,通過掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)分析、紅外光譜(Fourier transform-infrared spectroscopy,FT-IR)掃描將最佳者與粗提物的微觀結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)進(jìn)行初步探討。建立鉛中毒小鼠模型,對(duì)比低、中、高三種劑量的體外鉛吸附量最佳烏賊墨黑色素與藥物二巰基丁二酸(DMSA)[17]在小鼠肝臟和血中鉛的吸附能力,以期為烏賊墨黑色素高值化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏賊墨囊(約25 g/個(gè)) 取自虎斑烏賊(Sepiapharaonis Ehrenberg),杭州好時(shí)鮮水產(chǎn)品有限公司;堿性蛋白酶(4200 U/g) 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司;SPF級(jí)ICR小鼠 標(biāo)準(zhǔn)體重(20～24 g),雄性,浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(浙)2014-0001,飼養(yǎng)環(huán)境條件為屏障環(huán)境下,溫度22～25 ℃,相對(duì)濕度55%～70%;基礎(chǔ)飼料(蛋白質(zhì)脂肪碳水化合物產(chǎn)熱比為25.2∶11.9∶62.9)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院;蘇木精、伊紅染液 上海研臣實(shí)業(yè)有限公司;二巰基丁二酸膠囊 上海新亞閔行藥業(yè)有限公司;鹽酸、氫氧化鈉、硝酸、高氯酸等 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;醋酸鉛 分析純,上海化學(xué)試劑總廠。

GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LGJ-10C型冷凍干燥機(jī) 成都蘇凈科學(xué)儀器有限公司;TDL-5-A型大功率低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;Varian AA204DUO 原子吸收光譜儀 美國Varian公司;TV-3100FTIR 6700漫反射原位傅立葉紅外光譜分析儀 美國Thermo Scientific公司;日立S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;ETHOS900 型微波消解系統(tǒng) 意大利Milestone 公司;CK40型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烏賊墨黑色素的制備

1.2.1.1 烏賊墨粗提物 經(jīng)剪破的虎斑烏賊墨囊,擠壓去表皮膜和內(nèi)部網(wǎng)狀膜,5000 r/min高速均質(zhì)5 min后得到烏賊墨粗提物,置于4 ℃冰箱備用。

1.2.1.2 高速離心水洗法 參考Liu[14]等方法制備。將烏賊墨粗提物用等體積去離子水浸泡過夜后,1000 r/min離心10 min后得沉淀,加入沉淀質(zhì)量50倍的去離子水,5000 r/min離心20 min,反復(fù)操作3次后,將沉淀進(jìn)行冷凍干燥,設(shè)置真空室壓力為10 Pa,冷阱溫度-50 ℃,當(dāng)干基含水率為(4±0.5) g/g時(shí),干燥完成,即得水洗烏賊墨黑色素。將樣品分裝至真空密封袋中,4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.2.1.3 濃鹽酸水洗法 參考李興旺等[15]方法制備。將烏賊墨粗提物用等體積去離子水浸泡過夜后,1000 r/min離心10 min,用0.2 mol/L的HCl洗滌,磁力攪拌10 min,5000 r/min離心20 min過濾;在濃鹽酸的環(huán)境中,105 ℃下回流水解2 d,1000 r/min離心10 min后得沉淀,加入沉淀質(zhì)量50倍的去離子水進(jìn)行稀釋,5000 r/min離心10 min,反復(fù)操作3次,加0.2 mol/L的NaOH調(diào)pH至中性,將沉淀冷凍干燥,即得酸洗烏賊墨黑色素,分裝至真空密封袋中,4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.2.1.4 堿性蛋白酶酶解法 參考李曉等[16]方法。將烏賊墨粗提物用等體積去離子水浸泡過夜后,1000 r/min離心10 min后得沉淀;向沉淀中加入沉淀質(zhì)量50倍的去離子水,用0.2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH到10.5后加入4200 U/g的堿性蛋白酶,在50 ℃水浴中保溫酶解4 h,然后滅酶,1000 r/min離心10 min得沉淀;將沉淀用去離子水洗至中性,冷凍干燥,即得堿性蛋白酶酶解烏賊墨黑色素,分裝至真空密封袋中,4 ℃冰箱內(nèi)避光保存。

1.2.1.5 烏賊墨黑色素得率計(jì)算 黑色素得率p按公式(1)計(jì)算。

式(1)

式中,m0為烏賊墨黑色素冷凍干燥后的質(zhì)量(g);m為烏賊墨粗提物的質(zhì)量(g)。

1.2.2 烏賊墨黑色素體外實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 烏賊墨黑色素體外吸附實(shí)驗(yàn) 配制質(zhì)量濃度為800 mg/L的醋酸鉛溶液,取50 mL于150 mL錐形瓶中,加入100 mg烏賊墨黑色素,以0.2 mol/L的 HCl溶液和0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4.5,在25 ℃,150 r/min條件下恒溫振蕩3 h,反應(yīng)后5000 r/min離心20 min,取濾液。按照GB5009.12-2010《食品中鉛的測(cè)定》[18]測(cè)定濾液中鉛含量,每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。鉛的吸附量qt(mg/g)按式(2)計(jì)算。

式(2)

式中,V為溶液體積(L);C0為初始的重金屬濃度(mg/L);C為吸附后的重金屬濃度(mg/L);m為所用吸附劑的質(zhì)量(g)。

1.2.2.2 烏賊墨黑色素掃描電鏡(SEM)觀測(cè)實(shí)驗(yàn) 將烏賊墨粗提物、鉛吸附前后的烏賊墨黑色素使用掃描電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)掃描[19],對(duì)掃描后的圖片進(jìn)行成像分析,觀察它們的表面微觀結(jié)構(gòu)差異。

1.2.2.3 烏賊墨黑色素紅外光譜(FT-IR)掃描實(shí)驗(yàn) 參考王君等[20]的方法,利用聚苯乙烯膜對(duì)傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外波長校準(zhǔn)后,將鉛吸附前后的烏賊墨黑色素經(jīng)冷凍干燥處理后,采用溴化鉀(KBr)壓片法,使用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行分析,波數(shù)為4000～400 cm-1。

1.2.3 烏賊墨黑色素體內(nèi)吸附實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 小鼠分組及干預(yù) 將小鼠隨機(jī)分成6組,每組12只,分別為:陰性對(duì)照組、醋酸鉛模型組、藥物對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)低劑量組、中劑量組和高劑量組,在屏障環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。實(shí)驗(yàn)前各組小鼠均禁食不禁水 16 h。除陰性對(duì)照組飲用12.50 μL/L醋酸的去離子水外,其他各組均飲用1.00 g/L醋酸鉛水溶液(加入12.5 μL/L醋酸酸化)[21]。4 w后,采用灌胃的方式對(duì)小鼠進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組劑量為黑色素:50、100、200 mg/kg·d,陽性對(duì)照組為二巰基丁二酸(DMSA):100 mg/kg·d[22]。用去離子水溶解,按0.02 mL/g·bw給予。陰性對(duì)照組和醋酸鉛模型組分別灌胃等體積的生理鹽水,每日于上午9:00灌胃,持續(xù)8 w。

1.2.3.2 觀察指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間,觀察各組小鼠的中毒癥狀及死亡情況。分別于鉛中毒4 w和灌胃8 w時(shí),記錄存活小鼠的體重,取小鼠股動(dòng)脈采血,用帶有分離膠的真空采集血管收集,頸椎脫臼處死,迅速解剖取出肝臟,肉眼觀察肝臟并記錄結(jié)果后,0.85%的生理鹽水洗去血漬,吸水紙吸干表面水分后稱重。肝臟系數(shù)按式(3)計(jì)算。

式(3)

式中:m1為肝臟濕重(g);m0為小鼠體質(zhì)量(g)。

1.2.3.3 小鼠肝臟和血液鉛含量的測(cè)定 根據(jù)GB 5009.12-2010《食品中鉛的測(cè)定》[18],將小鼠的肝臟、血液均漿后,準(zhǔn)確稱取0.5 g左右,用硝酸-高氯酸(體積比4∶1)混合液10 mL進(jìn)行微波濕式消化,結(jié)束后趕酸,將消化液冷卻至室溫,定容至25 mL,測(cè)定溶液中鉛的含量。

1.2.3.4 蘇木精-伊紅(HE)染色法對(duì)小鼠肝臟細(xì)胞的觀察 灌胃8 w后,取各組小鼠新鮮肝臟用10%福爾馬林溶液固定,經(jīng)酒精梯度脫水后,二甲苯硬化,石蠟包埋,硬化后切片。采用HE染色法染色,光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟的組織化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同制備方法對(duì)烏賊墨黑色素鉛吸附量和得率的影響

由表1,對(duì)比3種方法的鉛吸附量可知,堿性蛋白酶酶解法的吸附效果最佳,達(dá)到(256.06±14.12) mg/g,高速水洗法的鉛吸附量在(219.85±16.98) mg/g,與劉漫[23]研究結(jié)果非常接近。與高速水洗法相比,濃鹽酸水洗法和堿性蛋白酶酶解法鉛吸附量分別提高16.47%±2.85%以及13.85%±2.47%;與濃鹽酸水洗法對(duì)比,堿性蛋白酶酶解法的提取烏賊墨黑色素的時(shí)間是前者的1/8,且酸法處理的烏賊墨黑色素廢液中含有強(qiáng)酸,而堿性蛋白酶酶解法反應(yīng)條件溫和,并且對(duì)環(huán)境的污染較小。雖然酶解得率略低于水洗法,為16.7%,但工藝簡(jiǎn)單,并且對(duì)設(shè)備要求不高。因此,本實(shí)驗(yàn)確定以酶法制備的烏賊墨黑色素為下一步研究對(duì)象。

表1 烏賊墨黑色素的鉛吸附量和得率Table 1 Lead adsorption capacity and yield of Sepia ink melanin

2.2 烏賊墨黑色素的SEM觀測(cè)分析

通過采用SEM技術(shù)對(duì)烏賊墨粗提物、堿性蛋白酶酶解法制備的烏賊墨黑色素吸附鉛前后超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測(cè),結(jié)果如圖1～圖3所示。由圖1可知,烏賊墨粗提物中的黑色素是由單個(gè)的黑色素單體相互聚集、堆積而成,其表面光滑而清晰,表現(xiàn)為圓形的單體顆粒,與李和生的研究結(jié)果一致[24]。這些生物大分子是由小的低聚物分子組成[25]。堿性蛋白酶酶解法處理(圖2)對(duì)烏賊墨黑色素的粒徑減小和均勻性的提高產(chǎn)生了一定的作用。雖然吸附鉛前后(圖2、圖3)的烏賊墨黑色素表面結(jié)構(gòu)變化不明顯,但對(duì)比后可發(fā)現(xiàn),吸附后的黑色素較吸附前的顆粒表面光滑度下降。

圖1 掃描電鏡觀測(cè)的粗提物超微結(jié)構(gòu)(45000×)Fig.1 Ultra structure of Sepia ink melanin(45000×)

圖3 酶解烏賊墨黑色素鉛吸附后超微結(jié)構(gòu)圖(45000×)Fig.3 Ultra structure of enzymatic hydrolysis Sepia ink melanin after the adsorption of lead(45000×)

2.3 烏賊墨黑色素的FT-IR掃描分析

堿性蛋白酶酶解法制備的烏賊墨黑色素吸附鉛前后FT-IR圖譜如圖4所示。圖中烏賊墨黑色素出現(xiàn)的一系列強(qiáng)且寬的吸收峰,是黑色素表面不同的功能基團(tuán)震動(dòng)疊加形成的。

圖4 烏賊墨黑色素鉛吸附前后的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of Sepia ink melanin before and after adsorption of lead

由表2可知，分析譜帶的歸屬,發(fā)現(xiàn)酶法制備的烏賊墨黑色素表面具有:-OH、-NH、-COOH、C6H5-(苯基)、C8H6N-(吲哚)等多種功能基團(tuán)[26]。吸收峰在1400 cm-1附近表示歸屬為真黑素的吲哚環(huán)[27],可以判斷烏賊墨黑色素的功能基團(tuán)中具有吲哚環(huán)結(jié)構(gòu),與李興旺等[15]以及呂玲等[28]的研究基本一致。烏賊墨黑色素吸附鉛后FT-IR圖像出現(xiàn)多處位移,較為明顯的有:吲哚和吡咯結(jié)構(gòu)單元中的N-H和O-H的伸縮振動(dòng)峰3391 cm-1移到3411 cm-1;-COOH的反對(duì)稱伸縮峰1406 cm-1移到1372cm-1,說明-OH,-NH,-COOH是參與吸附重金屬鉛的主要功能基團(tuán)。

表2 紅外波數(shù)和對(duì)應(yīng)的相關(guān)官能團(tuán)Table 2 FT-IR absorption bands and corresponding functional groups

2.4 烏賊墨黑色素和鉛對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

體質(zhì)量是反映機(jī)體發(fā)育是否正常的標(biāo)志[29]。由表3可知,染鉛4 w時(shí),各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體質(zhì)量與實(shí)驗(yàn)初始各組小鼠相比,體質(zhì)量在正常的增長范圍內(nèi)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,染鉛4 w各組差異不顯著(p>0.05)。灌胃8 w時(shí),各組與染鉛4 w的相比,體質(zhì)量均在合理增長范圍內(nèi),因而不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在建立鉛中毒小鼠模型和灌胃烏賊墨黑色素進(jìn)行鉛吸附期間,小鼠體質(zhì)量變化與鉛、烏賊墨黑色素相關(guān)性均不明顯,并沒有隨著染鉛以及灌胃時(shí)間的增加而發(fā)生顯著變化,與孫相和等[30]的結(jié)果相似。

表3 烏賊墨黑色素對(duì)實(shí)驗(yàn)期間小鼠體質(zhì)量變化影響Table 3 Effect of Sepia ink melanin on the weight of aged

2.5 小鼠肝臟系數(shù)的變化

表4可知,小鼠經(jīng)過醋酸鉛鉛中毒建模4 w后,各組與陰性對(duì)照組相比肝臟系數(shù)差異顯著(p<0.05)表明鉛對(duì)肝臟的生長存在不良影響。灌胃8 w后,利用SPSS 18.0以及EXCEL 2010對(duì)各組小鼠肝臟系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),除醋酸鉛模型對(duì)照外(p<0.05),其余不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異性(p>0.05)。

表4 小鼠肝臟系數(shù)Table 4 Weight and liver index of

2.6 鉛中毒模型分析

鉛中毒的模型有多種,有學(xué)者采用向小鼠腹腔注射醋酸鉛水來建模,也有學(xué)者采用給小鼠投喂含有鉛飼料的方法建模。本實(shí)驗(yàn)采用自由飲用醋酸鉛溶液的方法,建立小鼠鉛中毒模型。由表5知,染鉛4 w后,各實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟與血液中的鉛含量均顯著高于陰性對(duì)照組(p<0.01),表明小鼠鉛中毒模型構(gòu)建成功。

表5 染鉛4 w后各組小鼠組織中的鉛含量Table 5 Lead content in mice tissues after 4 w of lead

2.7 烏賊墨黑色素對(duì)小鼠肝臟和血液的影響

表6可見,與醋酸鉛模型組比較,各組小鼠肝臟和血中的鉛含量均低于醋酸鉛模型組,其中,低劑量差異顯著(p<0.05),藥物組,中、高劑量組差異極其顯著(p<0.01)。中,高劑量肝臟與血液的鉛含量分別下降17.18%±0.76%和31.09%±2.48%,20.85%±0.96%和34.45%±3.31%,兩組間差異均不顯著(p>0.05)。陽性對(duì)照組中血液與臟器中的鉛含量與模型組相比均有極顯著差異(p<0.01),鉛含量下降明顯,排鉛效果比各劑量黑色素組明顯。由此可知,中劑量和高劑量烏賊墨黑色素分別對(duì)鉛中毒小鼠肝臟和血液有較好的排鉛效果。

表6 灌胃8 w后各組小鼠的肝血中鉛含量(n=6,x±s)Table 6 Effect of Sepia ink melanin on lead amounts of liver and blood of lead-treated mice after 8w(n=6,x±s)

2.8 烏賊墨黑色素對(duì)小鼠肝臟組織細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)期間,各醋酸鉛模型組小鼠染鉛18 d時(shí)出現(xiàn)精神沉郁,反應(yīng)遲鈍,行動(dòng)緩慢,排尿量增大的情況,屬于鉛中毒現(xiàn)象。灌胃8 w后通過對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行HE染色以及病理組織分析如圖5所示。由圖5可知,陰性對(duì)照組肝臟細(xì)胞較為致密,而醋酸鉛模型組肝臟細(xì)胞受損較為嚴(yán)重,組織結(jié)構(gòu)疏松,存在斷裂現(xiàn)象。灌胃8 w后,與醋酸鉛模型組相比,各實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝臟組織不同程度地恢復(fù)致密;與藥物對(duì)照組相比,低劑量組肝臟組織致密程度較差,中劑量組與高劑量組對(duì)肝臟組織恢復(fù)較好,在組織致密程度和完整性上與陰性對(duì)照組相似。關(guān)于鉛對(duì)機(jī)體的毒性作用機(jī)理研究,Saini等[31]發(fā)現(xiàn)鉛在進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)誘發(fā)自由基對(duì)機(jī)體造成氧化損傷,抑制體內(nèi)的抗氧化物酶活性并加劇損害作用;任亞萍等[32]發(fā)現(xiàn)鉛會(huì)引起大量肝細(xì)胞的水樣變性,并在其中央靜脈周圍產(chǎn)生炎癥細(xì)胞的堆積。

圖5 小鼠肝臟切片觀測(cè)(HE染色,100×)Fig.5 Mice hepatic by HE staining(100×)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了高速水洗、濃鹽酸水洗以及堿性蛋白酶酶解三種處理方法制備所得烏賊墨黑色素的鉛吸附效果,結(jié)果表明,堿性蛋白酶法制備的烏賊墨黑色素對(duì)體外鉛吸附效果最好,吸附量達(dá)(256.06±14.12) mg/g,吸附率在80%以上。通過SEM微觀結(jié)構(gòu)和FT-IR掃描經(jīng)一步的觀察分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)堿性蛋白酶法制備的烏賊墨黑色素顆粒均勻、表面粗糙,吸附反應(yīng)發(fā)生在黑色素顆粒表層,-OH,-NH,-COOH是參與吸附重金屬鉛的主要功能基團(tuán)。采用鉛中毒小鼠模型,結(jié)果顯示,烏賊墨黑色素對(duì)小鼠體重以及肝臟系數(shù)不存在顯著性影響(p>0.05);對(duì)肝臟和血液中的鉛有一定的吸附效果,中、高劑量組與模型組比較差異極為顯著(p<0.01),對(duì)小鼠肝臟和血液的吸附率分別為17.18%±0.76%和31.09%±2.48%,20.85%±0.96%和34.45%±3.31%;HE染色法觀察小鼠肝臟,發(fā)現(xiàn)黑色素對(duì)緩減肝臟細(xì)胞的受損存在一定作用。本論文的研究結(jié)果可為利用烏賊墨黑色素開發(fā)新型生物吸附材料提供理論依據(jù)。