李艷，黃祥，伊航，蔡軼倫，林紅艷，劉還秀

（1.武漢理工大學(xué)醫(yī)院 外科，湖北 武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬黃家湖醫(yī)院 普通外科，湖北 武漢 430070）

肝癌作為常見惡性腫瘤受影響的因素較多，環(huán)境污染、乙肝感染、黃曲霉中毒等均可誘發(fā)本病。研究[1]提示肝硬化、肝炎等相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展均與原發(fā)性肝癌具有密切聯(lián)系，但具體相關(guān)發(fā)病機(jī)制仍存在爭議。肝癌的早期臨床癥狀較為隱匿，確診時(shí)多為晚期，多采用手術(shù)切除治療，但治療效果欠佳，因而本病的早期診斷及預(yù)后評估的研究具有重要意義。

Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中Smad4被證實(shí)與腫瘤及多器官硬化具有密切聯(lián)系[2]；NF-κBp65已在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)存在顯著表達(dá)，但上述兩種蛋白與肝癌的相關(guān)研究資料缺乏[3]。本研究探討Smad4和NF-κBp65蛋白在肝癌中的表達(dá)及意義，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年7月—2017年12月在我院治療的肝癌患者100例（觀察組），其中男62例，女38例；年齡35～67歲，平均年齡（50.03±9.91）歲；合并HBV感染60例；CHILD分級：A級36例，B級44例，C級20例。納入標(biāo)準(zhǔn)[4]：⑴ 均經(jīng)病理組織學(xué)確診原發(fā)性肝細(xì)胞癌；⑵ 術(shù)前未行放化療等抗腫瘤治療；⑶ 臨床病理資料完整；⑷ 患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 合并有其他惡性腫瘤者；⑵ 臨床病理資料不完整。同時(shí)選取因肝血管瘤切除的正常肝組織標(biāo)本42例作為對照組（排除合并有肝硬化、肝炎等其他疾?。瑑山M受試者性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）（表1）。

表1 兩組一般資料比較

1.2 免疫組化染色

免疫組化染色法檢測Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)。使用Envision二步法進(jìn)行，Smad4和NF-κBp65相關(guān)抗體購于美國Merck公司（批號20160521）。取所有患者及正常組織0.2 mg，常規(guī)石蠟包埋后切片后脫水，H2O2（3%）封閉后30 min內(nèi)源性過氧化酶孵育，20 min微波修復(fù)，分別加入Smad4和NF-κBp65一抗（均稀釋至1:1 000）后4 ℃過夜；常規(guī)PBS洗片分別加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗；DAB顯色后復(fù)染蘇木素；常規(guī)脫水、透明后封片觀察[5]。

1.3 結(jié)果判斷

采用半定量積分法，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，對染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例進(jìn)行評分，染色強(qiáng)度無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分；陽性細(xì)胞比例≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；兩者得分之積為最終得分，分?jǐn)?shù)≥4分為陽性表達(dá)[6]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 觀察組和對照組Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)

觀察組Smad4蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對照組（P＜0.05），而NF-κBp65蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對照組（P＜0.05）（表2）。

表2 觀察組和對照組Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)（%）

圖1 觀察組和對照組兩種蛋白(免疫組化，×400） A：觀察組Smad4蛋白表達(dá)；B：對照組Smad4蛋白表達(dá)；C：觀察組NF-κBp65蛋白表達(dá)；D：對照組NF-κBp65蛋白表達(dá)

2.2 Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征

有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Smad4蛋白陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；腫瘤直徑＞5 cm者NF-κBp65蛋白陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑≤5 cm者（P＜0.05）（表3）。

表3 Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系[n（%）]

2.3 相關(guān)性分析

將患者Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表4）。

表4 Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)相關(guān)性分析

3 討 論

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其早期癥狀不是非常明顯，不少患者被發(fā)現(xiàn)的時(shí)候就已經(jīng)發(fā)展為晚期，而與肝癌的預(yù)后效果有關(guān)的因素較多，早期檢查和治療都是直接影響肝癌的預(yù)后效果的重要因素[7]。故而，肝癌患者一定要積極的接受治療，要做到早發(fā)現(xiàn)，早預(yù)防，早治療。但目前關(guān)于肝癌早期診斷及預(yù)后評估有效指標(biāo)較為缺乏。

TGF-β作為配體形成的受體復(fù)合物，激活Smads進(jìn)入核內(nèi)，共同激活或抑制它們調(diào)節(jié)的靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。 Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的過程中起到關(guān)鍵性作用，且不同的Smad介導(dǎo)不同的TGF-β家族成員的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。Smad4是TGF-β家族各類信號傳導(dǎo)過程中共同需要的介質(zhì)與腫瘤及多器官硬化具有密切聯(lián)系[10]。

NF-κB主要涉及機(jī)體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細(xì)胞分化和調(diào)亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞。多數(shù)細(xì)胞類型中，NF-κB在胞漿與抑制性蛋白質(zhì)結(jié)合形成無活性的復(fù)合物。當(dāng)腫瘤壞死因子等作用于相應(yīng)受體后，可通過第二信使等激活此系統(tǒng)，而通過磷酸化抑制性蛋白使其構(gòu)象改變而釋放NF-κB，使得NF-κB得以活化；活化的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，接觸DNA，抑制或啟動(dòng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，其中NF-κBp65蛋白是數(shù)量最高的NF-κB蛋白[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)觀察組Smad4蛋白陽性表達(dá)率明顯低于對照組，而NF-κBp65蛋白陽性表達(dá)率明顯高于對照組。上述結(jié)果提示肝癌患者存在Smad4和NF-κBp65蛋白異常表達(dá)。VEGF在肝癌中高表達(dá),對肝癌新生血管形成及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移起重要作用。王玉恒等[12]研究提示Smad 4 具有降低腫瘤血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，抑制腫瘤血管形成的功能，是重要的抑癌基因并具有提高血小板反應(yīng)蛋白表達(dá)的作用。肝癌患者NF-κBp65蛋白高表達(dá)可能與NF-κB的活化促進(jìn)了血管基質(zhì)金屬蛋白酶或內(nèi)皮生長因子的表達(dá)有關(guān)，而基質(zhì)金屬蛋白酶或內(nèi)皮生長因子在腫瘤的血管發(fā)生、細(xì)胞外基質(zhì)降解和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。

Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征結(jié)果顯示有淋巴結(jié)患者Smad4蛋白陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者；腫瘤直徑＞5 cm患者NF-κBp65蛋白陽性表達(dá)率明顯高于腫瘤直徑≤5 cm患者。上述結(jié)果提示Smad4和NF-κBp65蛋白能夠共同促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，出現(xiàn)上述結(jié)果的具體機(jī)制可能是TGF-β1活化的啟動(dòng)子基因具有NF-κBp65蛋白結(jié)合位點(diǎn)，而TGF-β1表達(dá)可抑制Smad4表達(dá)，故而，Smad4能夠阻礙NF-κBp65的表達(dá)誘發(fā)凋亡并調(diào)節(jié)的腫瘤的侵襲及浸潤[13]。但本研究發(fā)現(xiàn)Smad4蛋白與肝癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而NF-Bp65與其無關(guān)，這可能與本研究樣本量較少有關(guān)，具體還需要進(jìn)行大樣本量研究證實(shí)。

Smad 7 屬于抑制型 I-Smads，抑制 TGF-β家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而 TGF-β在細(xì)胞的生長、分化、遷移、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用；核因子 NF-κB 是炎癥與癌的重要中介分子，許多細(xì)胞、病毒的基因組中存在κB 位點(diǎn)，因而眾多基因轉(zhuǎn)錄可以被 NF-κB 調(diào)控如肝臟炎性反應(yīng)相關(guān)基因、肝炎病毒相關(guān)基因、原癌基因、抑癌基因等多種基因都可以被其通過多種方式參與表達(dá)。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.350，P＜0.05）。上述結(jié)果提示肝癌患者的Smad4和NF-κBp65蛋白表達(dá)具有相關(guān)性。研究[14]證實(shí)胰腺癌 、膽管癌及結(jié)直腸癌多種腫瘤均存在Smad 4 基因表達(dá)顯著下降，在正常肝組織，Smad 4 具有重要的調(diào)節(jié) TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，而TGF-β對肝細(xì)胞生長具有較強(qiáng)的抑制作用?；罨腘F-κB快速的誘導(dǎo)編碼IkBa的基因的轉(zhuǎn)錄，因此產(chǎn)生高水平的自身抑制劑;釋放后的NF-κB可以通過例如修飾自身的亞單位的方式影響自身的轉(zhuǎn)錄激活效能[15]。新合成的自由的IkBa進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，然后使DNA上NF-κB解離并且將NF-κB排出細(xì)胞核，故而腫瘤多存在NF-κBp65的高表達(dá)。本研究為肝癌的相關(guān)發(fā)生機(jī)制提供了數(shù)據(jù)參考和研究對照，為今后肝癌機(jī)制的深入研究提供了基礎(chǔ)。

綜上所述，肝癌組織中Smad4表達(dá)降低，NF-κBp65蛋白表達(dá)升高，相關(guān)表達(dá)異常與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑大小具有一定的相關(guān)性。