余斌 ，丁佑銘 ，廖曉鋒

（1. 武漢大學(xué)人民醫(yī)院 肝膽腔鏡外科，湖北 武漢 430060；2. 消化系統(tǒng)疾病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060；3. 湖北省襄陽市中心醫(yī)院 普通外科，湖北 襄陽 441021）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居世界第6位，致死率居世界第2位[1]。現(xiàn)階段，盡管HCC的診療技術(shù)較前已有一定的提高，但HCC早期診斷困難、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點仍使得HCC患者的整體預(yù)后欠佳[2]。因此，深入研究HCC潛在的發(fā)生、發(fā)展機制，對于提升HCC的診治水平以及改善患者的預(yù)后有著重要意義。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA分子，其可在轉(zhuǎn)錄后水平與mRNA特異性結(jié)合下調(diào)靶基因的表達(dá)。諸多研究[3-4]表明，miRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，具有癌基因或抑癌基因的功能。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1180在多種實體腫瘤中存在異常表達(dá)，且呈現(xiàn)出一定的組織或腫瘤特異性。例如，miR-1180在肺癌和胰腺癌中表達(dá)上調(diào)，能促進癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并與肺癌患者TNM分期和不良預(yù)后密切相關(guān)；但miR-1180在膀胱癌中卻呈現(xiàn)低水平表達(dá)，發(fā)揮著抑癌基因的作用[5-7]。目前，miR-1180與HCC的相關(guān)性研究鮮有報道，故本研究基于GEO（Gene Expression Omnibus）和TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫來探討miR-1180在HCC組織中的表達(dá)情況及其臨床意義，并對miR-621靶基因進行系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析，以期為尋找新型HCC診斷標(biāo)志物或治療靶點提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究自GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載了數(shù)據(jù)集GSE36915 miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，包含68例HCC組織，21例癌旁組織。從TCGA數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載了377例HCC組織樣本和50例癌旁組織樣本的miRNAseq、mRNAseq表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)（3級數(shù)據(jù)），其中371例患者具有匹配的miRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)，365例患者具有匹配的miRNA表達(dá)譜、mRNA表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)分析 利用R（The Project for Statistical Computing）edgeR 包[8]（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html）分別對miRNA和mRNA表達(dá)譜進行過濾、歸一化處理，篩選HCC組織與癌旁組織之間差異表達(dá)mRNA和miRNA（篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2差異倍數(shù) |＞1，P＜0.05）。標(biāo)準(zhǔn)化后的 miRNA 和mRNA表達(dá)值以每100萬標(biāo)記讀本中外顯子的讀本數(shù)（counts of exon model per million mapped reads，CPM）表示，并經(jīng)log2轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。

1.2.2 患者分組 提取TCGA數(shù)據(jù)庫371例HCC患者匹配的miR-1180表達(dá)譜和預(yù)后數(shù)據(jù)，使用X-tile3.6.1（Yale University School of Medicine，New Haven，CT，USA）軟件[9]基于Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗確立最佳截斷值7.05，將患者分為miR-1180低表達(dá)組（n=250）和miR-1180高表達(dá)組（n=121）。

1.2.3 miR-1180靶基因預(yù)測及功能分析 使用 DIANA-microT（http:// diana.imis.athenainnovation.gr）、TargetScan v7.1（http://www.targetscan.org）、MiDRB（http://www.mirdb.org/）3個數(shù)據(jù)庫聯(lián)合（取交集）預(yù)測miR-1180靶基因；利用miRwalk（http://129.206.7.150/）、Tarbase（http://carolina.imis.athena-innovation.gr）、miRTraBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）3個數(shù)據(jù)庫檢索（取并集）已被實驗所證實的miR-1180靶基因。兩者的合集與HCC組織中差異低表達(dá)基因集合的交集即為本研究所確立的miR-1180靶基因集合。進而，利用在線 工 具 DAVID（https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對miR-1180靶基因進行基因本體論（Gene ontology，GO） 及 KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析。GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3個部分。

1.2.4 關(guān)鍵靶基因篩選 利用在線工具STRING[10]（https://string-db.org）聯(lián)合Cytoscape軟件[11]構(gòu)建miR-1180靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并運用CytoHubba插件依據(jù)連接度（degree）篩選出前30位關(guān)鍵基因（hub gene）。提取365例HCC患者關(guān)鍵基因的表達(dá)譜及預(yù)后數(shù)據(jù)，采用X-tile 3.6.1軟件篩選預(yù)后風(fēng)險基因，確立最佳截斷值并繪制Kaplan-Meier曲線。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用獨立樣本t檢驗。受試者工作特征曲線（ROC）用于評價指標(biāo)診斷效能，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）。生存分析采用Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗，并運用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析影響患者預(yù)后的危險因素，計算風(fēng)險比（hazard ratio，HR）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）。結(jié)局指標(biāo)采用患者總生存期（overall Survival，OS），即術(shù)后病理確診之日起至患者因任何原因死亡的間隔時間。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCC組織與癌旁組織miR-1180差異表達(dá)分析

GSE36915數(shù)據(jù)集與TCGA數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果一致顯示miR-1180在HCC組織中較癌旁組織差異高表達(dá)（均P＜0.0001），且對于HCC具有良好的診斷效能（GSE36915：AUC=0.8 704，P＜0.0 001；TCGA：AUC=0.8 450，P＜0.0 001）（圖1）。

圖1 miR-1180在HCC組織及癌旁組織中表達(dá)量及其診斷HCC的ROC曲線Figure 1 Expression levels of miR-1180 in HCC tissues and adjacent liver tissues, and ROC curves of miR-1180 for diagnosis of HCC

2.2 miR-1180表達(dá)與HCC患者臨床特征的關(guān)系

回顧性分析371例HCC患者miR-1180表達(dá)量與臨床特征關(guān)系，結(jié)果顯示miR-1180的表達(dá)水平與患者年齡、腫瘤家族史、腫瘤分化程度、AFP等密切相關(guān)（均P＜0.05），而與性別、TNM分期、纖維化評分、Child-Pugh分級、血管侵犯等指標(biāo)無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

表1 HCC患者miR-1180表達(dá)量與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Table 1 Relations of miR-1180 expression with clinicopathologic factors of the HCC patients

2.3 HCC患者預(yù)后影響因素分析

Kaplan-Meier分析提示HCC組織中miR-1180高表達(dá)涉及HCC患者不良預(yù)后（P=0.0 012）（圖2）。此外，單因素Cox回歸分析表明miR-1180表達(dá)量、TNM分期、血清甲胎蛋白與HCC患者OS密切有關(guān)（均P＜0.05）；多因素Cox回歸分析則進一步提示TNM分期（HR=1.734，95% CI=1.127～2.668，P=0.012）、miR-1180表達(dá)量（HR=1.692，95% CI=1.152～2.485，P=0.007）是影響HCC患者OS的獨立危險因素（表2）。

圖2 不同miR-1180表達(dá)量HCC患者的生存曲線Figure 2 Survival curves of HCC patients with different miR-1180 expression levels

表2 HCC患者總體生存率影響因素的Cox回歸分析Table 2 Cox regression analysis of factors affecting overall survival in HCC patients

2.4 miR-1180靶基因預(yù)測及功能分析

miR-1180有兩種成熟體形式：miR-1180-3p和miR-1180-5p，分別來源于miR-1180前體的3'端和5'端。本研究共篩選獲得miR-1180靶基因169個，其中miR-1180-3p靶基因39個，miR-1180-5p靶基因137個。富集分析提示miR-1180-3p的靶基因主要富集于脂質(zhì)運輸、上皮細(xì)胞遷移調(diào)控等生物過程（BP），低密度脂蛋白顆粒結(jié)合等分子功能（MF），以及乙醛酸和二羧酸代謝通路（KEGG）。miR-1180-5p主要富集于細(xì)胞雌二醇刺激應(yīng)答、細(xì)胞遷移調(diào)控等生物過程（BP），肝素結(jié)合、鈣離子結(jié)合等分子功能（MF），以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、補體級聯(lián)、脂肪酸降解等通路（KEGG）（圖3）。

2.5 miR-1180關(guān)鍵靶基因篩選

結(jié)合蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和預(yù)后分析結(jié)果，本研究共篩選出6個miR-1180關(guān)鍵靶基因：過氧化物酶增殖激活受體γ輔激活蛋白1α（peroxisome proliferator activated receptor γ coactivator 1 α，PPARGC1A）、乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2 family，ALDH2）、肌氨酸脫氫酶（sarcosine dehydrogenase，SARDH）、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 2，HMGCS2）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、E26轉(zhuǎn)錄因子2（ETS proto-oncogene 1 transcription factor，ETS2）；其中，ETS2為miR-1180-3p的靶基因；PPARGC1A、ALDH2、SARDH、HMGCS2、ESR1為miR-1180-5p的靶基因。上述6個基因在HCC組織中均呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，且相對低表達(dá)者與不良預(yù)后密切相關(guān)（均P＜0.05）；比對miR-1180-3p/5p及上述靶基因序列，證實了miR-1180-3p/5p可與相應(yīng)靶基因3'端非編碼區(qū)（3'-UTR）結(jié)合（圖4-5）。

圖3 miR-1180靶基因的功能及通路富集分析Figure 3 Functional and pathway enrichment analyses of the target genes of miR-1180

圖4 miR-1180靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 The protein-protein interaction networks of the target genes of miR-1180

圖5 miR-1180關(guān)鍵靶基因相關(guān)的生存曲線及miR-1180與其靶基因在3'-UTR的結(jié)合位點Figure 5 Survival curves associated with the key target genes of miR-1180 and the binding sites of miR-1180 in the 3’-UTR of the target genes

3 討 論

miRNA表達(dá)異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，深入研究miRNA與腫瘤的相關(guān)性將有望為腫瘤的診斷及治療提供新思路和新策略。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1180在多種腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞株中存在異常表達(dá)，且呈現(xiàn)出一定的組織或腫瘤特異性，發(fā)揮著癌基因（如肺癌、胰腺癌等）或抑癌基因（如膀胱癌等）的作用。例如，肺癌組織中高水平表達(dá)miR-1180與患者TNM分期及預(yù)后顯著相關(guān)[5]；胰腺癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-1180能下調(diào)靶基因TNIP2的表達(dá)，激活NF-κB信號通路，促進癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[6]；而膀胱癌細(xì)胞中miR-1180與抑癌基因P21均呈現(xiàn)低表達(dá)，若過表達(dá)miR-1180則能顯著上調(diào)P21表達(dá)水平，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[7]。因此，深入探討miR-1180在不同腫瘤中的作用及其機制有著非常重要的意義。

目前，對于miR-1180在HCC組織中的表達(dá)水平及其作用尚不十分明確。Zhou 等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)HCC組織（8例）及HepG2等HCC細(xì)胞株中miR-1180的表達(dá)水平較其癌旁組織及LO2正常肝細(xì)胞顯著上調(diào)，且過表達(dá)miR-1180可顯著下調(diào)其靶基因TNIP2、OTUD7B的表達(dá)，激活NF-κB信號通路，顯著增強癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力?？紤]到上述研究存在樣本量較少等不足，本研究首先基于GEO及TCGA數(shù)據(jù)庫的大樣本優(yōu)勢分析了miR-1180在HCC組織中的表達(dá)情況，證實了miR-1180在HCC組織中的表達(dá)水平較癌旁組織顯著上調(diào)；另外，ROC曲線結(jié)果顯示miR-1180表達(dá)量能較好地區(qū)分HCC組織和癌旁組織，提示了miR-1180具有作為HCC病理診斷標(biāo)志物的潛在價值。

此外，本研究進一步探討了HCC組織中miR-1180表達(dá)量與HCC患者臨床病理指標(biāo)及預(yù)后間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)miR-1180在低或未分化HCC組織中表達(dá)相對較高，且miR-1180表達(dá)量與腫瘤家族史相關(guān)，這提示了miR-1180密切涉及HCC的發(fā)生與發(fā)展。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)HCC組織中miR-1180表達(dá)量與HCC患者血清甲胎蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。已有研究證實，多種miRNA分子在腫瘤患者癌組織及血清中可同時存在表達(dá)異常，且具備一定的穩(wěn)定性和組織特異性，例如miR-215[14]、miR-329[15]等。目前，筆者暫未發(fā)現(xiàn)miR-1180在HCC患者血清中表達(dá)量的相關(guān)研究，對于miR-1180能否成為一種新型HCC血清分子診斷標(biāo)志物，以及能否聯(lián)合AFP用于HCC患者的早期診斷有待進一步的研究闡明。此外，Kaplan-Meier分析提示HCC組織中高表達(dá)miR-1180與HCC患者不良預(yù)后有關(guān)，且多因素Cox回歸分析證實miR-1180表達(dá)量是影響HCC患者預(yù)后的獨立危險因素。因此，結(jié)合miR-1180的表達(dá)水平及其與臨床病理指標(biāo)和預(yù)后的相關(guān)性，推測miR-1180在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中主要發(fā)揮癌基因的作用。

基于miRNA-mRNA互作原理以及系統(tǒng)的生物信息學(xué)方法，我們還首次對miR-1180的靶基因進行了較為全面的預(yù)測并功能分析。富集分析提示miR-1180的靶基因主要富集于脂質(zhì)代謝、細(xì)胞遷移、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能，以及脂肪酸降解及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解等通路。諸多研究表明，脂質(zhì)代謝紊亂是腫瘤代謝的重要特征之一，一方面脂質(zhì)代謝為腫瘤細(xì)胞的異常增殖供給大量能量；另一方面多種脂質(zhì)分子是細(xì)胞膜、脂質(zhì)信號分子的重要組分，參與諸多腫瘤相關(guān)通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，涉及腫瘤（包括HCC）的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成等生物學(xué)過程[16-17]。目前，筆者暫未發(fā)現(xiàn)miR-1180參與調(diào)控脂質(zhì)代謝的相關(guān)研究，深入研究miR-1180、脂質(zhì)代謝、HCC三者間的相關(guān)性無疑具有廣闊前景。

為進一步揭示miR-1180在HCC中的作用機制，本研究結(jié)合靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及預(yù)后分析篩選出6個miR-1180潛在關(guān)鍵靶基因，分別為ETS2、PPARGC1A、ALDH2、SARDH、HMGCS2、ESR1；其中PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1為脂質(zhì)代謝調(diào)控相關(guān)基因。現(xiàn)有研究表明，PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1等4個關(guān)鍵靶基因與HCC的發(fā)生、發(fā)生過程密切相關(guān)。與本研究結(jié)果一致，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1等基因在HCC中均呈現(xiàn)低表達(dá)，且與患者不良預(yù)后有關(guān)；此外，當(dāng)上調(diào)HCC細(xì)胞株中上述基因的表達(dá)水平則可通過調(diào)控相關(guān)信號通路（如AMPK信號通路、轉(zhuǎn)錄因子SP1等）顯著抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移或侵襲等生物學(xué)過程，提示了PPARGC1A、ALDH2、HMGCS2、ESR1在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用[18-22]。目前，ETS2、SARDH與HCC關(guān)系的研究鮮有報道。作為MAPK/ERK通路的重要底物之一，ETS2的異常表達(dá)與多種腫瘤關(guān)系密切，且所起作用具有一定的組織特異性，發(fā)揮著癌基因（如喉癌等）或抑癌基因（如肺癌等）的作用[23-24]。SARDH是調(diào)控肌氨酸代謝的關(guān)鍵酶之一，其異常表達(dá)同樣涉及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。Lim等[25]發(fā)現(xiàn)SARDH在HCC組織中較正常肝組織低表達(dá)，提示SARDH與HCC的發(fā)生、發(fā)展緊密相關(guān)，但具體作用及機制尚不明確。Khan等[26]發(fā)現(xiàn)SARDH在前列腺癌中低表達(dá)，當(dāng)過表達(dá)SARDH則可顯著抑制癌細(xì)胞的增殖能力，發(fā)揮抑癌基因的作用。結(jié)合本次研究靶基因差異表達(dá)分析和預(yù)后分析結(jié)果，推測ETS2和SARDH在HCC中同樣作為抑癌基因而存在?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果及文獻復(fù)習(xí)，我們認(rèn)為HCC中miR-1180高表達(dá)可誘導(dǎo)其關(guān)鍵靶基因（ETS2、PPARGC1A、ALDH2、SARDH、HMGCS2、ESR1等）表達(dá)水平的異常上調(diào)，并由此促進HCC的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，本研究基于GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫合并系統(tǒng)的生物信息學(xué)方法揭示了miR-1180可作為一種促癌基因參與HCC的發(fā)生、發(fā)展，并擁有作為HCC診斷標(biāo)志物、預(yù)后指標(biāo)及治療靶點的潛在應(yīng)用價值?？傊敬紊镄畔W(xué)分析將有望為日后HCC發(fā)病機制的研究以及診治方法的改善提供新策略、開辟新路徑，但miR-1180及其靶基因在HCC中作用及其機制還有待后續(xù)實驗予以證實及豐富。