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(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007)

0 引 言

脫氧核糖核酸(DNA)在遺傳信息的存儲(chǔ)和蛋白質(zhì)的合成中起到非常重要的作用，而鳥(niǎo)嘌呤是DNA中的重要嘌呤堿基，參與能量傳遞、新陳代謝及細(xì)胞信號(hào)傳遞；黃嘌呤是嘌呤核苷酸的代謝產(chǎn)物，在黃嘌呤氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為尿酸；尿酸被認(rèn)為是人體內(nèi)嘌呤代謝的氧化最終產(chǎn)物，廣泛的分布于人體血液、尿液及其它生物體的器官及體液中[1]. 尿酸、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤含量的檢測(cè)與多種疾病的診斷、監(jiān)測(cè)、預(yù)防和治療都有著密切的聯(lián)系，如免疫系統(tǒng)的缺陷和突變、痛風(fēng)及高尿酸血癥. 因此，檢測(cè)尿酸、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤含量的變化對(duì)于人類(lèi)健康和臨床醫(yī)學(xué)有著重要的意義，能為多種嘌呤代謝相關(guān)的疾病提供參考診斷數(shù)據(jù)[2, 3].

已報(bào)道的常用的檢測(cè)方法有分光光度法、熒光法、毛細(xì)管電泳法、電化學(xué)法等，電化學(xué)分析法作為一種常用的檢測(cè)方法在電極的修飾上尤為重要. 氧化石墨烯量子點(diǎn)是一種新型零維納米材料，其粒徑小于100 nm[4]，本實(shí)驗(yàn)制備的RGOQDs / GCE對(duì)尿酸和嘌呤有著較強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng)，并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，可用于細(xì)胞中嘌呤代謝產(chǎn)物的定量檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)單、高效、靈敏度高，具有明顯的應(yīng)用前景.

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

采取差分脈沖伏安法在CHI 660電化學(xué)分析儀上室溫25 ℃進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)；三電極檢測(cè)體系，工作電極為玻碳電極，銀/氯化銀參比電極和鉑絲對(duì)電極；全套的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備.

氧化石墨烯量子點(diǎn)(GOQDs，先豐納米材料科技有限公司)，尿酸(UA，Sigma)、黃嘌呤(X，Sigma)，鳥(niǎo)嘌呤(G，Sigma)；磷酸鹽緩沖溶液是由0.2 M 磷酸二氫鈉(NaH2PO4，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)和0.2 M磷酸氫二鈉(Na2HPO4，上?；瘜W(xué)試劑有限公司)制備而成；所用水溶液均為雙蒸水配制并于4 ℃冰箱保存.

1.2 RGOQDs / GCE的制備

采用肼還原的方法制備RGOQDs[5]，玻碳電極的表面用氧化鋁粉拋光直到得到鏡面的表面，在雙蒸水和乙醇溶液中各超聲5min，然后浸入到RGOQDs溶液中通過(guò)電沉積的方程修飾于電極表面，RGOQDs / GCE備用.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與收集

V79細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)上海細(xì)胞庫(kù)，在含有胎牛血清、盤(pán)尼西林、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用原位細(xì)胞收集法收集細(xì)胞[6].

2 結(jié)果與討論

2.1 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤檢測(cè)的電化學(xué)行為研究

為了研究尿酸、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤在RGOQDs / GCE的電化學(xué)行為，分別對(duì)9 μM尿酸、5 μM黃嘌呤、6μM鳥(niǎo)嘌呤、及三種混合標(biāo)準(zhǔn)品于磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，采用差分脈沖伏安法其檢測(cè)結(jié)果如圖1所示. 尿酸在0.3 V(a曲線)左右出現(xiàn)了明顯的信號(hào)，黃嘌呤(b曲線)和鳥(niǎo)嘌呤(c曲線)在0.7 V左右出現(xiàn)了明顯的信號(hào)，而當(dāng)三種標(biāo)準(zhǔn)品混合后，黃、鳥(niǎo)嘌呤的電化學(xué)信號(hào)無(wú)法分開(kāi)，只呈現(xiàn)了一個(gè)電化學(xué)峰(d曲線)，這種現(xiàn)象在文獻(xiàn)中已有報(bào)道. 由此可見(jiàn)RGOQDs / GCE可被用于靈敏的檢測(cè)尿酸和黃、鳥(niǎo)嘌呤，若檢測(cè)物中同時(shí)含有黃嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤會(huì)得到一個(gè)混合的峰.

圖1 (a)尿酸；(b)黃嘌呤；(c)鳥(niǎo)嘌呤；(d)三種混合標(biāo)準(zhǔn)品的曲線圖

2.2 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤檢測(cè)最佳富集電位的選取

為了研究RGOQDs / GCE電極對(duì)尿酸、嘌呤的最佳檢測(cè)條件，首先研究了富集電位的影響，圖2為不同富集電位下的尿酸(圖2 A)、鳥(niǎo)嘌呤(圖2 B)、黃嘌呤(圖2 C)在RGOQDs / GCE的電化學(xué)信號(hào)點(diǎn)線圖. 由圖可見(jiàn)，尿酸(圖2 A)在 - 0.3 V的電化學(xué)信號(hào)最強(qiáng)且曲線平滑，富集電位的改變對(duì)鳥(niǎo)嘌呤(圖2 B)、黃嘌呤(圖2 C)的影響并不大，但黃、鳥(niǎo)嘌呤均在0 V信號(hào)最強(qiáng)且曲線平滑，富集電位越小其曲線上漂，由于要同時(shí)對(duì)尿酸和嘌呤進(jìn)行檢測(cè)，綜上選取0 V為最佳富集電位.

圖2 不同富集電位尿酸(A)；鳥(niǎo)嘌呤(B)；黃嘌呤(C)

電化學(xué)信號(hào)點(diǎn)線圖；嵌圖： DPV曲線原圖

a - g為 - 0.3，- 0.2，- 0.1，0，0.1，0.2，0.3 V

2.3 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤檢測(cè)最佳富集時(shí)間的選取

除去富集電位，富集時(shí)間也是電化學(xué)檢測(cè)中?？紤]的一個(gè)檢測(cè)條件，圖3為不同富集時(shí)間尿酸、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的電化學(xué)信號(hào)點(diǎn)線圖，富集時(shí)間為0，30，120，240，300，420，480 s. 由圖可以看出，經(jīng)富集后的標(biāo)準(zhǔn)品信號(hào)強(qiáng)度明顯大于無(wú)富集時(shí)的電流強(qiáng)度，且隨著時(shí)間的增加，電化學(xué)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，在360 s時(shí)電化學(xué)信號(hào)最明顯，電極也比較穩(wěn)定，且考慮到實(shí)驗(yàn)時(shí)間，選取360 s為最佳富集時(shí)間.

圖3 不同富集時(shí)間尿酸(a)；黃嘌呤(b)鳥(niǎo)嘌呤(c)電化學(xué)點(diǎn)線圖

圖4 pH對(duì)尿酸(a)；黃嘌呤(b)；鳥(niǎo)嘌呤(c)氧化峰電位(A)和峰電流(B)影響點(diǎn)線圖

2.4 RGOQDs / GCE用于尿酸、嘌呤檢測(cè)最佳pH的選取

圖4為pH(3 - 9)對(duì)尿酸(a)、黃嘌呤(b)、鳥(niǎo)嘌呤(c)氧化峰電位(圖4 A)和峰電流(圖4 B)的影響點(diǎn)線圖. 由圖4 A可見(jiàn)，三種標(biāo)準(zhǔn)品的氧化峰電位隨著酸度的增加而增加，線性方程分別為：EUA= 0.679 - 0.0529 pH(R= 0.995)；EX= 1.06507 - 0.05441 pH(R= 0.997)；EG= 1.048 - 0.052pH (R= 0.996)，根據(jù)電化學(xué)理論，三種標(biāo)準(zhǔn)品在電極表面發(fā)生的是兩電子伴隨兩質(zhì)子的氧化反應(yīng). 圖4 B可見(jiàn)，三種標(biāo)準(zhǔn)品的峰電流隨著酸度的增加而增加，說(shuō)明在酸性條件下，RGOQDs / GCE電極對(duì)三種標(biāo)準(zhǔn)品有著較強(qiáng)的電化學(xué)響應(yīng).

2.5 RGOQDs / GCE用于V79細(xì)胞的電化學(xué)行為研究

將RGOQDs / GCE電極用于V 79細(xì)胞的電化學(xué)行為研究，結(jié)果如圖5所示，在0.3 V和0.7 V處出現(xiàn)了明顯的電化學(xué)信號(hào)，歸因于細(xì)胞代謝生成的尿酸和黃、鳥(niǎo)嘌呤的混合信號(hào).

圖5 V 79細(xì)胞的電化學(xué)曲線

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)制備了RGOQDs / GCE電極，將其用于尿酸、黃嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤的檢測(cè)并對(duì)檢測(cè)的最佳條件進(jìn)行了選取，該電極具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，并成功的用于實(shí)際樣品分析，應(yīng)用差分脈沖伏安法對(duì)V 79細(xì)胞代謝物進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果令人滿意.