陳 娜，程 磊，孟 肖，姚 潔

亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,亳州，236800

紫菀為常用中藥，具有潤(rùn)肺下氣，消痰止咳的作用。2015年版《中國(guó)藥典》收載其來(lái)源為菊科植物紫菀(AstertataricusL.f.)的干燥根和根莖[1]。紫菀根莖呈不規(guī)則塊狀，大小不一，頂端有莖、葉的殘基,質(zhì)稍硬。根莖簇生多數(shù)細(xì)根，多編成辮狀；表面紫紅色或灰紅色，有縱皺紋，質(zhì)較柔韌。深入產(chǎn)地調(diào)研紫菀僅有亳州、安國(guó)兩地栽培生產(chǎn)，對(duì)紫菀基源形態(tài)鑒定發(fā)現(xiàn)，兩地紫菀同為菊科紫菀屬植物，繁殖材料為地下根狀莖。由于長(zhǎng)期采用根莖繁殖，出現(xiàn)了品種退化、紫菀酮含量達(dá)不到藥典標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)象。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，目前多數(shù)學(xué)者關(guān)注紫菀酮和其他化學(xué)成分的研究[2-3]及藥理藥效方面的研究[4]。關(guān)于紫菀組織培養(yǎng)方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文對(duì)紫菀的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，以期獲得試管苗后進(jìn)行脫毒培養(yǎng)，改善紫菀品種退化、質(zhì)量下降的現(xiàn)狀。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試亳州地產(chǎn)紫菀采集于亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥用植物園。所述材料經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院程磊副教授鑒定，為菊科紫菀屬植物紫菀。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲得

挑選生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲(chóng)害的帶芽根狀莖(圖1)，截成2 cm左右，去除葉柄殘基，流水下沖洗2 h,通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]后，分別在75%的酒精和0.1%的升汞中處理(處理時(shí)間見(jiàn)表1)，無(wú)菌水沖洗4遍后，切去根狀莖兩端和芽頭底端褐化的部分，接入滅菌后的MS培養(yǎng)基，每瓶接種2段，每個(gè)處理接種20瓶，培養(yǎng)10 d后，觀察統(tǒng)計(jì)污染率和死亡率,為了獲得大量的無(wú)菌苗，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果取3次的平均值。

表1 紫菀根狀莖在升汞和酒精中處理的時(shí)間

1.2.2 紫菀試管苗的增殖培養(yǎng)

將獲得的無(wú)菌側(cè)芽從根狀莖上輕輕切下，除去基部的愈傷組織，接入增殖培養(yǎng)基，每瓶接種2棵。增殖培養(yǎng)時(shí)以MS為基本培養(yǎng)基，添加蔗糖25 g·L-1、瓊脂粉8 g·L-1及不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)(見(jiàn)表2)，pH調(diào)至5.85，培養(yǎng)14 d后觀察增殖情況。

1.2.3 紫菀試管苗的生根培養(yǎng)

選擇健壯的試管苗，切去基部的愈傷組織或褐化部分，接入生根培養(yǎng)基,以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖25 g·L-1,瓊脂粉8 g·L-1,設(shè)置不同的激素濃度(見(jiàn)表3),pH調(diào)至5.85,每瓶接種10棵，每個(gè)處理接種5瓶，14 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

圖1 無(wú)菌叢芽的獲得

編號(hào)6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-1編號(hào)6-BA/mg·L-1NAA/mg·L-111.00.122.00.133.00.141.00.552.00.563.00.571.01.082.01.093.01.0

表3 生根培養(yǎng)時(shí)激素的種類和濃度

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)紫菀根狀莖和芽頭的影響

不同的消毒時(shí)間處理后，供試紫菀的根狀莖污染率和死亡率存在差異。在酒精消毒時(shí)間一定時(shí)，隨著升汞消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，紫菀根狀莖的污染率降低；在升汞消毒時(shí)間一定時(shí)，隨著酒精消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡率明顯升高。培養(yǎng)6～7 d后，未污染和死亡的根狀莖萌發(fā)出芽，在10～20 d開(kāi)始出現(xiàn)葉片，在20～30 d葉片達(dá)到3片。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果(見(jiàn)表4)綜合考慮污染率和死亡率，最終選擇75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min,紫菀根狀莖污染率為32.5%，死亡率為37.5%，而且后期能進(jìn)行正常生長(zhǎng)。

表4 污染數(shù)和死亡數(shù)的統(tǒng)計(jì)

2.2 不同激素組合后對(duì)紫菀無(wú)菌苗增殖的影響

經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)：不同濃度組合的6-BA和NAA對(duì)紫菀試管苗增殖的影響不同。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，試管苗增殖不明顯，相對(duì)于NAA為0.5 mg·L-1時(shí)的試管苗生長(zhǎng)緩慢，接種的部分芽頭形成多個(gè)芽，但部分褐化死亡。隨著兩種激素濃度的升高，形成叢生芽的數(shù)量增加，當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，部分試管苗基部形成了愈傷組織，而且形成的愈傷組織很難分化，尤其在6-BA濃度達(dá)到3.0 mg·L-1，NAA濃度達(dá)到1.0 mg·L-1時(shí)，部分試管苗開(kāi)始玻璃化，停止生長(zhǎng)。根據(jù)試管苗的增殖和生長(zhǎng)情況，最終確定MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1為紫菀試管苗最佳的增殖培養(yǎng)基。培養(yǎng)一段時(shí)間后，叢芽增殖后生長(zhǎng)旺盛。

2.3 生長(zhǎng)素對(duì)紫菀試管苗生根的影響

通過(guò)生根實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫菀的試管苗生根容易，不添加任何生長(zhǎng)素的情況下，試管苗培養(yǎng)14 d后即可生根，但是形成的根比較細(xì)，色白。當(dāng)同時(shí)添加NAA和IBA各0.5 mg·L-1，培養(yǎng)一周，有部分根從試管苗基部冒出，相對(duì)較粗壯。但同時(shí)使用1.0 mg·L-1的NAA和IBA，試管苗基部形成很多的愈傷組織，部分愈傷組織分化出根，此種根不能供給植物營(yíng)養(yǎng)。綜合上述情況，最終確定MS+IBA0.5 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1為最佳的生根培養(yǎng)基。

3 總結(jié)和討論

本文利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)獲得了亳州地產(chǎn)紫菀的試管苗。通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選，確定了紫菀根狀莖適宜的消毒時(shí)間為75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min。試管苗增殖和生根的培養(yǎng)基分別為MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1和MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1+瓊脂8 g·L-1。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，紫菀地下根狀莖的取材時(shí)間與消毒時(shí)的死亡率有很大的關(guān)系。由于本研究的第一批和第二批實(shí)驗(yàn)分別開(kāi)始于2017年3月和2017年4月，紫菀地下根狀莖活力低，消毒時(shí)很容易死亡；第三批實(shí)驗(yàn)開(kāi)始于2017年5月初，此時(shí)氣溫回暖，地下根狀莖活力強(qiáng)，生長(zhǎng)活躍，同樣的消毒時(shí)間處理后，成活率高。紫菀植株全體被白色柔毛，用葉片做外植體消毒困難；用根狀莖做外植體時(shí)，取材時(shí)間過(guò)早，活力低，不宜萌發(fā)；取材過(guò)遲，芽頭變白色，細(xì)弱，消毒時(shí)易死亡。因此，選擇適宜的取材時(shí)間是建立無(wú)菌體系至關(guān)重要的一環(huán)。

在組織培養(yǎng)培過(guò)程中，首次消毒成功后，雖然獲得了無(wú)菌芽，但后期有一小部分植株葉背及芽頭頂端極易出現(xiàn)團(tuán)狀的白色毛，停止生長(zhǎng)；而且部分苗在無(wú)菌培養(yǎng)的過(guò)程中極易感染細(xì)菌，推測(cè)紫菀體內(nèi)可能存在內(nèi)生菌，但還需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。