丁夢蝶 ，朱佳文 ，梁璐琪 ，張毅 ，陳斌 ，邵靚

（1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；2.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所，四川 溫江 611130）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS，俗稱豬藍(lán)耳病）于1987年首次在美國發(fā)現(xiàn)，我國于1996年首次分離到PRRSV美洲型經(jīng)典毒株（CH-1a），2006年我國大面積暴發(fā)高致病性PRRS，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。2013年以來，我國部分地區(qū)又出現(xiàn)了歐洲型PRRSV毒株[2]以及美洲型NADC30類病毒（NADC30-like）[3-4]。PRRSV 是單股正鏈 RNA 病毒，基因組的變異使得新毒株不斷出現(xiàn)。ORF5編碼主要囊膜蛋白GP5，該蛋白是病毒與細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)，包含病毒中和位點，在結(jié)構(gòu)蛋白中變異率最高，因此ORF5基因是研究PRRSV遺傳進(jìn)化及分子流行病學(xué)的重要靶基因。本研究應(yīng)用RT-PCR法從2016～2017年采集自四川地區(qū)的疑似PRRSV感染病料中擴(kuò)增ORF5基因，并進(jìn)行序列分析，以了解近兩年來PRRSV在四川地區(qū)的流行特點，為有效防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 疑似PRRSV感染豬病料來自于2016年和2017年四川地區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查采樣，保存于-80℃。

1.2 主要試劑 柱式RNA提取試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨動物防疫技術(shù)有限公司；RT-PCR一步法試劑盒，購自寶生物（大連）工程有限公司。

1.3 樣品處理 取病死豬的組織樣品，用無菌鑷子剪碎，加入滅菌PBS（pH 7.2），然后在樣品制備系統(tǒng)中破碎，離心后取上清用于RNA提取,提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 ORF5基因的擴(kuò)增和序列測定 使用Zhou L等[5]設(shè)計的引物ORF5-F、ORF5-R擴(kuò)增ORF5基因，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為682bp。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：25μL 2×1step buffer、2μL Enzyme mix、上下游引物各 1μL（20μmoL）、4μL RNA、17μL RNase Free H2O，反應(yīng)總體積為50μL。RT-PCR反應(yīng)條件：50℃ 30 min，94℃ 2min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 50s，共 32 個循環(huán)；72℃ 8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)有目的條帶后送上海生工進(jìn)行T載體克隆和測序。

1.5 ORF5基因的序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件對所測得的ORF5基因序列，以及CH-1a（AY032626）、JXA1 （EF112445）、VR-2332（AY150564）、NADC30（JN654459）、QYYZ（JQ308798）、LV（M96262）等參考毒株的ORF5基因序列進(jìn)行同源性分析和序列比對。用MEGA6軟件Neighbor-Joining法進(jìn)行遺傳變異分析，設(shè)置自展值（bootstrap）為1000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 ORF5基因的測序結(jié)果 經(jīng)測序后共得到12個ORF5基因序列。對測序結(jié)果進(jìn)行剪切后，長度均為603bp，編碼200個氨基酸。

2.2 序列同源性分析 12個ORF5基因序列之間的核苷酸序列同源性為82.3%～99.8%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為81.1%～99.5%。與美洲型毒株CH-1a、JXA1、VR-2332、NADC30、QYYZ 的 ORF5 基因的核苷酸序列同源性分別為85.1%～95.4%、83.6%～99.5%、85.1%～89.4%、83.9%～94.2%、82.8%～90.9%，與歐洲型代表株LV的核苷酸序列同源性僅為61.4%～64.6%；推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為85.6%～93.5%、83.6%～98.5%、83.1%～88.6%、84.1%～93.5%、80.6%～93.0%，與LV氨基酸序列的同源性僅為53.3%～58.9%。

2.3 遺傳變異分析 基于ORF5基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹如圖1所示。

圖1 基于ORF5基因序列的遺傳進(jìn)化樹

PRRSV毒株分為美洲型（Type 2）和歐洲型（Type 1）兩個基因型。美洲型毒株可以分為5個亞群，分別以JXA1、CH-1a、NADC30、VR-2332 和 QYYZ 毒株為代表。本研究中的12個序列均屬于美洲型，其中有10個 （O-01-2016、O-02-2016、O-03-2016、O-04-2016、O-01-2017、O-02-2017、O-03-2017、O-04-2017、O-07-2017、O-08-2017）屬于以 JXA1 毒株為代表的 I亞群，另 2個（O-06-2017、O-05-2017）分別屬于以NADC30株為代表的Ⅲ亞群和以QYYZ毒株為代表的V亞群。

2.4 ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸比對分析 抗原表位區(qū)域和毒力位點均存在氨基酸變異。與所在亞群的代表株相比，在 B 細(xì)胞表位 1（27～30aa）中，O-08-2017株發(fā)生 V29→A29突變，O-06-2017株發(fā)生A27→V27突變；在 B 細(xì)胞表位 2（37～45aa）中，O-02-2016株發(fā)生I39→F39突變；在B細(xì)胞表位3（180～197aa）中，O-02-2016株發(fā)生 L196→Q196突變，O-04-2016株發(fā)生 R191→K191突變，O-07-2017、O-08-2017株發(fā)生L196→R196突變。在T細(xì)胞表位區(qū)域，與所在亞群的代表株相比，I亞群中O-02-2016株發(fā)生 I121→V121、V124→I124突變，O-07-2017株發(fā)生R151→K151突變，O-08-2017株發(fā)生I121→L121突變；Ⅲ亞群中O-06-2017株發(fā)生120LI121→120FF121、K129→R129、K163→R163 突變；V亞群中O-05-2017株發(fā)生F117→L117、I121→T121、I124→V124、Y153→H153 突變。在毒力位點的第 13 位 aa，O-05-2017、O-06-2017 株為 Q13，其余為 R13；第 151 位 aa，O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017株為K151，其余為R151。

3 討論

在PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白中，普遍認(rèn)為編碼GP5蛋白的ORF5基因最容易發(fā)生變異，因此可通過分析ORF5基因的變異情況來研究PRRSV的分子流行病學(xué)[6-7]。PRRSV主要分為以LV株為代表的歐洲型毒株和以VR-2332株為代表的美洲型毒株，兩者之間的核苷酸序列同源性約60%。本研究中12個美洲型ORF5序列與LV株ORF5基因的核苷酸序列同源性僅為61.4%～64.6%，符合這一現(xiàn)象。此外，雖然都屬于美洲型，但12個ORF5序列之間的核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性相互之間有較大差異，也符合ORF5基因變異大的特點。

PRRSV流行毒株的ORF5基因在抗原表位區(qū)域和毒力位點均有發(fā)生氨基酸突變的報道[8]。在抗原表位區(qū)域有6個ORF5序列（O-02-2016、O-04-2016、O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017、O-08-2017）發(fā)生了以下突變：A27→V27、V29→A29、I39→F39、I121→V121、V124→I124、K163→R163、R191→K19 1、L196→R196、L196→Q196 等。這些突變可能會引起抗原性改變，進(jìn)而影響疫苗免疫效果。在毒力相關(guān)位點，強(qiáng)毒株為R13和R151，弱毒株為Q13和G151。在第 13 位 aa，2 株（O-05-2017、O-06-2017）出現(xiàn)毒力致弱（R13→Q13）；在第 151位 aa，3株（O-05-2017、O-06-2017、O-07-2017）可能出現(xiàn)毒力改變（R151→K151）。此外，已知ORF5序列的前31位氨基酸為信號肽序列，是GP5蛋白的高變區(qū)，本研究中除 O-02-2016、O-03-2016、O-04-2016 外的其他序列在第10～30aa均有氨基酸突變。

4 結(jié)論

本研究12個ORF5序列中，有10株與高致病性毒株JXA1的親緣關(guān)系較近，有1株與NADC30毒株的親緣關(guān)系較近，另1株與廣東分離株QYYZ的親緣關(guān)系較近，可見四川地區(qū)近兩年流行的PRRSV以高致病性的JXA1亞型為主，也有少量NADC30亞型和QYYZ亞型毒株出現(xiàn)，應(yīng)密切關(guān)注。