班新偉，康如如，魏凌云，魯周民

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

枇杷(Eriobotryajaponica)系薔薇科蘋果亞科枇杷屬植物，主要分布在長江以南各省，是原產(chǎn)于我國的著名亞熱帶水果[1]，含人體所需的多種營養(yǎng)組分，具有極高的營養(yǎng)價值[2]，同時具有極高的醫(yī)療價值，并且枇杷的果實、種子、花、葉子均可入藥[3]?！侗静菥V目》記載，枇杷具有化痰止咳和胃降氣的功效[4]?，F(xiàn)有的研究中，以果實為主，葉片次之，對花的相關(guān)研究相對較少。

枇杷果樹80%～90%的枝條可形成花穗，每花穗約有30～260朵花，一般為70～110朵，但僅有5%～20%的花可結(jié)成果實[5]。因此，通過疏花、疏果來調(diào)節(jié)生長與結(jié)果的關(guān)系，減少養(yǎng)分消耗，提高產(chǎn)量品質(zhì)和商品價值，是枇杷豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、高效的一項重要技術(shù)措施[6]。

近年來，枇杷花的價值越來越受到人們重視，對其研究不斷深入。研究表明，枇杷花含有人體所需的18種氨基酸以及維生素C、抗衰老素等和黃酮類、酚類物質(zhì)、三萜類等多種藥用成分[7]，具有提神養(yǎng)氣、清肺潤喉、化痰止咳等功效。枇杷花中含有豐富的類黃酮和酚酸類等生物活性成分[8]，其中黃酮類主要的藥理作用為護(hù)肝、活血化瘀、降脂、抗腫瘤、抑菌及抗氧化、抗衰老和抗疲勞、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等[9]。酚類物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)上的特點是在苯環(huán)上具有一個或多個羥基，通常以酯化或糖苷化的形式存在于植物組織中，正是這種特殊的結(jié)構(gòu)，使其具有猝滅單線態(tài)氧和清除自由基的作用[8]。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于枇杷花所含總黃酮和總酚的研究主要集中在化學(xué)成分鑒定和含量測定[10-12]、藥效學(xué)研究[13-15]以及提取工藝[16-18]等方面，關(guān)于枇杷花功能成分及抗氧化性能隨時間變化研究未見報道。本文主要對不同生長時期枇杷花中的黃酮、總酚含量以及抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行測定，并對各指標(biāo)間進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在為枇杷花功能成分更深層次的研究以及適宜的疏花時期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：枇杷花，采自西北農(nóng)林科技大學(xué)校園枇杷園的實生枇杷樹。

試劑：三氯化鐵、氯化鈉、氯化鉀與過硫酸鉀產(chǎn)自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水碳酸鈉、沒食子酸、蘆丁、無水乙醇、氫氧化鈉產(chǎn)自廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)；福林酚試劑(1N)產(chǎn)自上海荔達(dá)生物科技有限公司；鹽酸、乙酸鈉產(chǎn)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；ABTS、DPPH、Trolox、TPTZ產(chǎn)自上海藍(lán)季生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

KH-500DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)、H1850醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、UV-VIS紫外可見分光光度計、破碎機(jī)(九陽股份有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 采樣 在枇杷花開放后，從2017年11月2日開始，每隔7 d左右，在枇杷樹四周采樣1次，至2017年12月16日結(jié)束，共采樣7次。每次采樣時間均為10：00-11:00，采樣質(zhì)量分別為：48.2、44.6、50.1、42.2、51.3、48.7 g和43.6 g。

1.3.2 樣品處理 樣品采回后立即放入破碎機(jī)中，粉碎5 min成粉末狀。精確稱取枇杷花粉末2.5 g(精確到0.000 1 g)3份于3個50 mL離心管中，分別加入50%、75%乙醇和無水乙醇溶液25 mL，遮光浸提12 h。再超聲輔助提取30 min、溫度35℃、超聲頻率100 Hz。在轉(zhuǎn)速9 800 r/min下離心10 min。取上清液分裝于10 mL儲液管中冷凍保存?zhèn)溆?。為消除樣品本身差異帶來的誤差，本試驗中每個處理重復(fù)9次。

1.4 指標(biāo)測定方法

1.4.1 總黃酮含量 參照文獻(xiàn)[19]，采用硝酸鋁比色法測定總黃酮含量。

稱取蘆丁0.1 g,用50%乙醇定容至100 mL,超聲20 min輔助溶解。精密移取濃度為1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0(1號管)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL和1.4 mL于10 mL試管中，依次分別加入75%乙醇3.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8 mL和1.6 mL搖勻，各加入5%亞硝酸鈉1.0 mL，搖勻，靜置6 min，加入1.0 mL 10%的硝酸鋁，搖勻，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液5 mL，靜置15 min，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度顯色溶液。以1號管溶液作參比，在510 nm處測定吸光值。以吸光值y對質(zhì)量濃度進(jìn)行回歸，y=12.257x+0.036 7，R2=0.999 2。標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁含量在0～0.14 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。

分別取枇杷花溶劑系統(tǒng)提取液0.5 mL代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液,按此方法測定，計算結(jié)果，結(jié)果以mg·g-1表示。

1.4.2 總酚含量 參照文獻(xiàn)[20]，采用Folin-Ciocalteu比色法測定總酚含量。

精密移取濃度為0.1 mg·mL-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液0(1號管)、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于10 mL試管中。依次加入8.0、7.8、7.6、7.4、7.2、7.0、6.8、6.6 mL蒸餾水，0.5 mL FC顯色劑， 1.5 mL 7.5%碳酸鈉溶液混勻，置于75℃水浴加熱15 min，冷卻至室溫。以1號管溶液做參比，在765 nm處測定吸光值。以吸光值y對沒食子酸濃度進(jìn)行回歸，y=84.071x+0.034，R2=0.997 6。標(biāo)準(zhǔn)品沒食子酸含量在0～0.014 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。

分別取枇杷花溶劑系統(tǒng)提取液0.2 mL代替沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液按此方法測定，各樣品9個重復(fù)，結(jié)果以mg·g-1表示。

1.4.3 DPPH自由基清除率 參照文獻(xiàn)[21]，在試劑用量和時間上略加修改。

將50%和75%乙醇浸提液稀釋20倍，無水乙醇浸提液稀釋10倍，吸取樣液各0.2 mL于試管中，加入0.1 mmol/L DPPH 4 mL,混勻，室溫25℃左右避光反應(yīng)30 min,517 nm下測定吸光值(Ai)。吸取0.2 mL樣液與4 mL 無水乙醇于試管中混勻，同樣的方法測定吸光值(Aj)；將4 mL DPPH與0.2 mL浸提溶劑于試管中混勻，同樣的方法測定吸光值(Ac)。按下列公式計算清除率(K)。

K=(1-(Ai-Aj)/Ac)×100%

1.4.4 ABTS自由基清除率 參照文獻(xiàn)[22]測定ABTS自由基清除率。

用蒸餾水配制7 mmol/L ABTS溶液，與2.45 mmol/L K2S2O8,1∶1混合于棕瓶中，反應(yīng)過夜(12～16 h)，測定之前用PBS緩沖液稀釋至734 nm下的吸光值為0.7±0.002。

將50%和75%乙醇浸提液稀釋20倍，無水乙醇浸提液稀釋10倍，吸取0.1 mL樣液,再加入3.99 mL ABTS反應(yīng)液于試管中混合均勻，37°水浴10 min,734 nm下測定吸光值(As)。將樣品的浸提溶劑與ABTS反應(yīng)液于試管中混合均勻，按上述方法測定吸光值(Ac)。按下列公式計算清除率(K)。

K=(1-As/Ac)×100%

1.4.5 FRAP試驗 參照吳媛琳[2]的方法進(jìn)行FRAP試驗。

將300 mmol/L乙酸鈉、10 mmol/L TPTZ(用40 mmol/L HCl配制)與20 mmol/L FeCl3按10∶1∶1的比例混合均勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。吸取0.6 mL的400、200、100、50、25、12.5、6.25、0 μmol/L Trolox標(biāo)液于各試管中，再加入4.5 mL預(yù)熱至37℃的FRAP工作液，37℃反應(yīng)10 min,593 nm測定吸光值。以Trolox濃度μmol/L為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.003 5x+0.016,R2=0.997 3。結(jié)果顯示，Trolox濃度在0～400 μmol/L范圍內(nèi)與吸光值線性關(guān)系良好。

將50%和75%乙醇浸提液稀釋200倍，無水乙醇浸提液稀釋100倍，用同樣的方法測定樣品吸光值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相應(yīng)的Trolox濃度μmol/L,結(jié)果用Trolox當(dāng)量表示(μmol TEAC/g)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel2010，SPSS20.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析、差異性分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮含量隨時間變化分析

由圖1可知，枇杷花在開放的不同時期中，總黃酮的含量呈先上升后下降的趨勢。3種乙醇濃度提取法，總黃酮含量變化規(guī)律相近。2017-11-02的樣品50%、75%和無水乙醇浸提液總黃酮含量依次為(7.549±0.041)mg·g-1、(6.325±0.082)mg·g-1和(2.257±0.052)mg·g-1，含量較低；之后含量開始上升。2017-11-27的樣品50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液總黃酮含量依次為(20.401±0.474)mg·g-1、(22.599±0.254)mg·g-1和(8.331±0.000)mg·g-1，含量達(dá)到最高值；在后續(xù)測定中又呈現(xiàn)降低的趨勢，2017-12-11的樣品50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液總黃酮含量依次為(16.474±0.457)mg·g-1、(14.962±0.180)mg·g-1和(6.140±0.294)mg·g-1。

通過差異性檢驗得出，50%與75%乙醇浸提液總黃酮含量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于無水乙醇浸提處理總黃酮含量(P<0.05)。

圖1 黃酮含量隨時間變化

2.2 總酚含量隨時間變化分析

由圖2可知，枇杷花在開放的不同時期中，總酚的含量呈先上升后下降的趨勢，變化幅度較小。3種乙醇濃度提取法，總酚含量變化規(guī)律相近。2017-11-02的樣品50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液總酚含量依次為(3.858±0.036)mg·g-1、(3.233±0.024)mg·g-1和(2.060±0.009)mg·g-1，含量較低；2017-11-27的樣品50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液總酚含量依次為(5.840±0.079)mg·g-1、(5.702±0.016)mg·g-1和(3.727±0.055)mg·g-1，在采樣時間區(qū)段達(dá)到了高值；2017-12-04的樣品總酚含量與2017-11-27差異不顯著(P>0.05)，50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液總酚含量依次為(5.638±0.144)mg·g-1、(5.640±0.080)mg·g-1和(3.995±0.055)mg·g-1。后續(xù)的樣品，總酚含量呈現(xiàn)下降的趨勢。

通過差異性檢驗得出，50%與75%乙醇浸提處理總酚含量差異不顯著(P>0.05)，但均顯著高于無水乙醇浸提液總酚含量(P<0.05)。

2.3 DPPH清除率隨時間變化分析

由圖3可知，枇杷花在開放的不同時期，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。3種乙醇濃度浸提法，DPPH自由基清除率變化趨勢相近。2017-11-02的DPPH自由基清除率50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液依次為(14.798±0.706)%、(21.786±0.950)%和(3.042±0.239)%。之后呈上升趨勢。不同浸提方法均在2017-12-04日左右達(dá)到峰值，50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液測得的DPPH自由基清除率依次為(79.094±1.153)%、(80.281±2.493)%和(35.115±0.933)%，顯著高于其他時間(P<0.05)。之后開始下降，2017-12-16的DPPH自由基清除率介于11.20與11.27的測定值，50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液依次為(41.010±1.915)%、(55.132±1.491)%和(9.994±0.912)%。

圖2 總酚含量隨時間變化

圖3 不同采樣時間枇杷花的DPPH自由基清除率

通過差異性檢驗得出，50%和75%乙醇浸提液測得的DPPH自由基清除率差別不顯著(P>0.05)，但均顯著高于無水乙醇浸提液(P<0.05)。

2.4 ABTS自由基清除率隨時間變化分析

由圖4可知，枇杷花在開放的不同時期，清除ABTS+·的能力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。不同濃度乙醇浸提液變化趨勢相同。2017-11-02的ABTS自由基清除率50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液分別為(28.167±1.342)%、(29.167±1.933)%和(8.283±0.466)%。之后呈上升趨勢，2017-11-27達(dá)到峰值，50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液的ABTS自由基清除率依次為(77.642±0.84)%、(78.963±1.458)%和(47.188±1.268)%，顯著高于其他時間(P<0.05)。之后開始下降，2017-12-16的ABTS自由基清除率50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液分別為(18.149±1.388)%、(25.813±1.233)%和(6.428±0.739)%，為整個觀測過程中的最低值。

通過差異性檢驗得出，50%和75%乙醇浸提液的ABTS自由基清除率差別不顯著(P>0.05)，但均顯著高于無水乙醇浸提液(P<0.05)。

圖4 ABTS.+法測定不同采樣時間枇杷花的自由基清除率

2.5 FRAP試驗體系中抗氧化活性隨時間的變化分析

由圖5可知，枇杷花在開放的不同時期，用FRAP法測抗氧化活性先升高后降低，不同浸提方法趨勢變化相同。抗氧化活性用Trolox當(dāng)量表示，2017-11-02的50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液的抗氧化活性依次為(209.587±3.223)μmol TEAC/g、(171.429±4)μmol TEAC/g和(73.905±4.466)μmol TEAC/g。之后呈上升趨勢，不同浸提液均在2017-12-04左右達(dá)到峰值，顯著高于其他時間(P<0.05)。50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液的抗氧化活性依次表示為(406.540±10.876)μmol TEAC/g、(436.952±7.800)μmol TEAC/g和(144.571±3.010)μmol TEAC/g。之后呈下降趨勢，2017-12-16的抗氧化活性稍高于開始時的測定值，50%、75%乙醇和無水乙醇浸提液依次為(232.127±3.014)μmol TEAC/g、(271.587±3.330)μmol TEAC/g和(85.810±2.106)μmol TEAC/g。

通過差異性檢驗得出，50%和75%乙醇浸提液測得的抗氧化活性差別不顯著(P>0.05)，但均顯著高于無水乙醇浸提液(P<0.05)。

2.6 5個指標(biāo)間的相關(guān)性分析

表1中的黃酮、總酚含量以及抗氧化活性指標(biāo)的數(shù)據(jù)，均為7個批次的試驗全部結(jié)束后，將各次試驗數(shù)據(jù)取平均值所得。提取溶劑為75%乙醇。

由表1可以看出，總酚含量和FRAP試驗體系下測得的抗氧化活性之間有較高的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)為0.953；除此之外，黃酮含量和ABTS自由基清除率之間也有較高的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)為0.954。而對同一類指標(biāo)來說，功能性成分中總酚含量與黃酮含量之間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)為0.917；對抗氧化活性的指標(biāo)來說，DPPH自由基清除率與FRAP試驗體系下測得的抗氧化活性間表現(xiàn)出一定的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)為0.916。

圖5 FRAP法測不同采樣時間的枇杷花抗氧化活性

表1 5個指標(biāo)的相關(guān)性分析

注：**.在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*.在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

黃酮含量與DPPH自由基清除率的相關(guān)性較低，相關(guān)性系數(shù)僅為0.646；DPPH自由基清除率與ABTS自由基清除率之間也有較低的相關(guān)性，相關(guān)性系數(shù)為0.601。

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，枇杷開花后，隨著生長時間的變化，花中總黃酮和總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，DPPH、ABTS自由基清除率和FRAP試驗體系下測定的抗氧化活性也呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，均在11月末12月初達(dá)到峰值。

枇杷花在11月底到12月初，總黃酮和總酚的含量顯著高于其他時間，抗氧化活性也在此時期達(dá)到峰值，為疏花利用提供了理論指導(dǎo)。上述疏花時間與王智圣[7]等提供的疏花穗時間基本一致。

50%與75%乙醇浸提處理的枇杷花總黃酮與總酚含量、3種抗氧化活性測定的指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)，但均顯著高于無水乙醇浸提處理(P<0.05)，為疏掉的枇杷花的利用方法提供參考。該結(jié)論與王靜波[13]的研究結(jié)論基本一致，枇杷花各提取物總黃酮含量為50%乙醇提取物>75%乙醇提取物>95%乙醇提取物。

對枇杷花的功能成分和抗氧化活性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析得出，ABTS自由基清除率與總黃酮含量、FRAP試驗體系下測定的抗氧化活性與總酚含量間分別存在較高的相關(guān)性(相關(guān)性系數(shù)>0.9)。

試驗中提取液制備為濕提，還未見相關(guān)報導(dǎo)，關(guān)于干花的研究頗多，總黃酮含量在2.257～22.599 mg·g-1；蔣定文[21]等測定的白沙枇杷干花總黃酮含量為38.7 mg·g-1；黃瓊[18]等用60%乙醇提取枇杷干花總黃酮為83.7 mg·g-1。不同研究者得到的結(jié)果不同，除處理差異和誤差所致外還可能與枇杷花富含綠原酸有關(guān)，綠原酸的存在對總黃酮的測定有顯著的影響[22]。總酚含量的測定，該試驗總酚含量在2.060～5.840 mg·g-1；周春華[23]用乙醇提取的枇杷干花總酚含量為8.3367 mg·g-1。枇杷花功能成分含量的差異與多種因素有關(guān)，有待于進(jìn)一步探究。