李匯涓 徐 勝 肖和衛(wèi)

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021)

脂肪組織不僅是能量儲存器官，也是內(nèi)分泌器官，能夠分泌瘦素、脂聯(lián)素、腫瘤壞死因子(TNF)-α、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)4等細胞因子，參與動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生〔1〕。甘精胰島素作為糖尿病治療的一線藥物，廣泛應用于臨床治療。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，甘精胰島素能夠糾正糖尿病患者體內(nèi)血脂代謝紊亂〔2〕，但機制仍未明確。本實驗擬分析不同濃度甘精胰島素對人皮下前脂肪細胞分化和脂質(zhì)代謝的影響及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 脂肪組織來于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院行開腹手術(shù)的6例患者，男2例、女4例，年齡50.17歲，術(shù)前行口服糖耐量試驗排除糖尿病，排除嚴重感染、重要器官和系統(tǒng)功能不全者，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，組織取材均經(jīng)患者知情同意。主要試劑：胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶均購于北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司；脂肪因子檢測試劑盒、Trizol試劑盒均購于上海廣銳生物科技有限公司。

1.2前脂肪細胞原代培養(yǎng)基鑒定 術(shù)中取患者腹部皮下脂肪組織約15 g，磷酸緩沖液洗滌后剪碎，Ⅰ型膠原酶消化，接種至含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，光學顯微鏡下觀察細胞生長情況。消化傳代，取3～5代對數(shù)期前脂肪細胞，流式細胞術(shù)檢測表面抗原(CD44、CD105、CD31、CD34)，鑒定培養(yǎng)的前脂肪細胞相關(guān)生物活性。

1.3誘導分化及甘精胰島素干預 取5～8代對數(shù)期前脂肪細胞，調(diào)整細胞濃度至1×106/ml接種至6孔板，待細胞完全覆蓋后加入無血清分化培養(yǎng)基，前3 d加1 mmol/L的成脂誘導分化劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)，誘導2 w后，油紅O染色鑒定成脂分化；分化過程中分別加入濃度為125、250、500、1 000 nmol/L的甘精胰島素進行干預，每3 d收集上清液。

1.4脂肪因子檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測分化第3、7、14天前脂肪細胞上清液中脂肪因子瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、RBP4水平；比色法檢測前脂肪細胞中脂質(zhì)代謝指標三酰甘油含量及甘油釋放量；具體操作嚴格按試劑盒說明進行。

1.5qRT-PCR檢測目的基因表達 Trizol法提取前脂肪細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)-γ、促進結(jié)合蛋白(CEBP)α、RBP4、激素敏感性酯酶(LPL)、β-actin引物由上海滬宇生物科技有限公司設計合成。SYBR GREEN Ⅰ染料法在熒光定量PCR儀上擴增，總反應體系20 μl，反應條件：95℃ 40 s;95℃ 10 s;60℃ 30 s;72℃ 1 min，共40個循環(huán)。擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，2-△△Ct計算目的基因mRNA相對表達量。

1.6統(tǒng)計學分析 使用SPSS21.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1前脂肪細胞鑒定及誘導分化 流式細胞術(shù)檢測顯示，干細胞表面標志物CD44、CD105呈強陽性，表達率超過97%，而內(nèi)皮細胞標志物CD31、CD34呈陰性，說明培養(yǎng)的原代前脂肪細胞具有干細胞特性。前脂肪細胞經(jīng)IBMX成脂誘導分化2 w，細胞呈圓形，胞內(nèi)可見透亮脂滴填充，部分細胞間相互融合成片；胞內(nèi)脂滴可被油紅O染呈橘紅色，見圖1。

2.2不同濃度甘精胰島素對脂肪因子的影響 隨著脂肪細胞逐漸分化成熟，瘦素、脂聯(lián)素分泌量明顯增加，TNF-α、RBP4分泌量明顯減少。分化第7和14天時，不同濃度組瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、RBP4分泌量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中濃度甘精胰島素(250、500 nmol/L)對瘦素、脂聯(lián)素分泌的促進作用，對TNF-α、RBP4分泌的抑制作用最明顯。見表1。

2.3不同濃度甘精胰島素對脂質(zhì)代謝的影響 隨著脂肪細胞逐漸分化成熟，胞內(nèi)三酰甘油含量逐漸增加；甘精胰島素250、500 nmol/L組三酰甘油含量明顯高于125、1 000 nmol/L組(P<0.05)。脂質(zhì)合成的同時伴隨脂質(zhì)分解，胞內(nèi)甘油釋放量隨分化時間的變化不明顯，與甘精胰島素的干預濃度呈正比，甘精胰島素1 000 nmol/L組甘油釋放量明顯高于125、250、500 nmol/L組(P<0.05)。見表2。

2.4前脂肪細胞分化過程中基因轉(zhuǎn)錄水平變化 隨脂肪細胞分化時間延長，各目的基因轉(zhuǎn)錄水平逐漸增加，不同時間點PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL mRNA相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表1 不同濃度甘精胰島素對各分化時間脂肪因子分泌水平的影響

與甘精胰島素125 nmol/L組比較：1)P<0.05；與250 nmol/L組比較：2)P<0.05；與500 nmol/L組比較：3)P<0.05

表2 不同濃度甘精胰島素對脂質(zhì)合成和分解的影響

與甘精胰島素250、500 nmol/L組比較：1)P<0.05;與甘精胰島素1 000 nmol/L組比較：2)P<0.05

表3 前脂肪細胞分化不同時間點各目的基因mRNA表達水平

與0、3、7 d比較：1)、2)、3)P<0.05

3 討 論

近年來，肥胖被歸為慢性炎癥疾病范疇，脂肪組織可通過分泌多種細胞因子參與糖尿病、動脈粥樣硬化等發(fā)生〔3〕。本實驗結(jié)果顯示，隨著前脂肪細胞分化成熟，瘦素、脂聯(lián)素、TNF-α、RBP4分泌量均明顯增加，中濃度甘精胰島素對脂肪因子分泌的促進效果最明顯。相關(guān)研究顯示，胰島素可促進小鼠L1細胞中脂聯(lián)素的分泌〔4〕。高胰島素血癥、慢性炎癥存在于2型糖尿病或肥胖患者中，導致促炎性脂肪因子(TNF-α、RBP4)分泌量增加，當給予胰島素治療后，促炎性脂肪因子分泌量減少，抗炎脂肪因子(瘦素、脂聯(lián)素)分泌量增加，進一步從體外細胞實驗證明了胰島素在人體中的抗炎作用。細胞脂質(zhì)代謝包括脂質(zhì)的合成和分解，可分別通過細胞中三酰甘油含量和甘油釋放量來反映。相關(guān)研究顯示，上調(diào)PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL基因表達可提升細胞中cAMP水平，進而促進PKA活性，誘發(fā)β腎上腺素受體信號傳導，促進脂肪降解〔5〕。本研究顯示，甘精胰島素是促進脂質(zhì)合成的同時也能夠誘導脂肪分解，其中脂質(zhì)合成與脂肪細胞分化進程有關(guān)，中濃度甘精胰島素對脂質(zhì)合成的促進效果最明顯；但脂質(zhì)分解與分化進程關(guān)系不大，與甘精胰島素濃度呈正相關(guān)，高濃度甘精胰島素促進脂質(zhì)分解效果最明顯。進一步對前脂肪細胞分化不同時間點目的基因mRNA表達情況分析顯示，PPAR-γ、CEBPα、RBP4、LPL mRNA相對表達量隨分化時間延長明顯提升，可能參與甘精胰島素對脂肪細胞脂質(zhì)代謝的調(diào)控。