湯璐璐 鄧偉民* 蘇海容 袁人飛

1. 廣東藥科大學，廣東 廣州 510006 2. 廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，廣東 廣州 510010 3. 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510403

5年臨床觀察發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆?？梢杂行Ь徑饨^經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和老年男性骨質(zhì)疏松癥患者疼痛的癥狀，提高骨礦含量和骨密度，降低骨折發(fā)生率，且無明顯不良反應(yīng)，價格便宜[1-2]。衰老導致的生長激素分泌不足也是引發(fā)老年男性骨質(zhì)疏松的重要原因之一，文獻表明生長激素可以通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸刺激成骨細胞的復制和骨基質(zhì)的合成，防治中老年男性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，目前被認為是治療骨質(zhì)疏松最有前途的藥物之一[3]，但研究表明rhGH的應(yīng)用會引發(fā)某些副作用，且有潛在致惡性腫瘤的風險[4],價格昂貴，故對于生長激素的運用仍舊比較謹慎。本研究以快速老化雄性小鼠(senescence accelerated male mice,SAMP6)為老年男性骨質(zhì)疏松模型，以生長激素為陽性對照藥，分析補腎壯骨顆粒對SAMP6股骨結(jié)構(gòu)及生物力學性能的影響，并探討是否有可能替代生長激素進行對老年男性骨質(zhì)疏松的治療。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

本研究以30只清潔級3月齡快速老化骨質(zhì)疏松模型雄性小鼠(SAMP6)和10只同源正常雄性小鼠(SAMR1)為研究對象。所有動物(許可證號：SCXK-津-2015-0003)均來自天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心SAM品系小鼠繁育屏障系統(tǒng)，國家二級動物房飼養(yǎng)及運動干預(yù)，終年環(huán)境維持在相對濕度55%-60%，室溫23±2 ℃，每小時自動換風16次，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)光照的條件。

1.2 方法

1.2.1藥物與儀器：補腎壯骨顆粒(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，批號15K04001)主要由骨碎補、龜甲膠、鹿角膠、淫羊藿、水蛭、山藥、巴戟天7味中藥組成，由廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供。尤得盼注射用重組人生長激素(4IU(1.33 mg)/瓶，產(chǎn)品批號UTR15020)由(株)LG生命科學制造，購自廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科。858MiniBionix型材料測試系統(tǒng)(MTS;USA)，Micro-CT儀(viva CT40;SCANCO Medical AG)。

1.2.2實驗分組及給藥方法：SAMP6(30只)被隨機平均分為模型組(MG)、中藥組(CMG)和生長激素組(GHG)，每組10只，選取10只正常老化雄性小鼠(SAMR1)作為同源對照組(NG)。每天給藥一次，給藥劑量為臨床等效劑量(補腎壯骨顆粒灌胃3.5 g/kg[5]，重組人生長激素皮下注射1μg/g)，模型組和正常組給予等量的生理鹽水。每隔一周進行一次體重稱量，并結(jié)合體重調(diào)整給藥劑量。3個月后每組隨機選取5只小鼠去眼球取血處死，取其左側(cè)股骨，并徹底剔除軟組織，用Micro-CT儀掃描測定股骨骨量，858MiniBionix型材料測試系統(tǒng)行股骨三點彎曲應(yīng)力試驗測量與分析，加載速度為5 mm/min，跨距為10 mm,股骨斷裂后，用電子游標卡尺測量橫截面外層長軸、外層短軸、內(nèi)層長軸、內(nèi)層短軸，6個月后采取同樣的方法處理剩余的小鼠。

1.2.3測量指標：(1)股骨力學幾何尺寸 ①骨橫截面外層長軸②骨橫截面外層短軸③骨橫截面內(nèi)層長軸④骨橫截面內(nèi)層短軸⑤骨橫截面面積(bone)⑥骨髓腔橫截面積(Marrow cavity)⑦橫截面皮質(zhì)骨面積(Cortical bone)。

(2)股骨力學幾何量 截面慣性矩(moment of inertia)由公式(π/64)×(D14-D24)得出，極慣性矩(polar moment of inertia)由公式(π/32)×(D14-D24)得出，抗彎截面模數(shù)(Modulus of flexural)由公式(π/32)×(D14-D24)/D1得出，抗扭截面模數(shù)(Modulus of torsion)由公式(π/16)×(D14-D24)/D1得出，式中D1為股骨外徑(exter-diameter，平均值)，D2為骨髓腔內(nèi)徑(inter-diameter，平均值)。

(3)骨量參數(shù) 用Micro-CT儀掃描測定股骨整體骨礦密度(BMD)。

(4)生物力學性能 生物力學性能指標采用858MiniBionix型材料測試系統(tǒng)測試得到:(1)結(jié)構(gòu)力學參數(shù)：①最大載荷(max-load)②彈性載荷(elasticity load)③最大繞度(Max-winding)④最大彎矩(max- bending moment)⑤能量吸收(absorption of energy)；(2)材料力學參數(shù)：①最大應(yīng)力(max-stress)②彈性應(yīng)力(elastic stress)③剛性系數(shù)(coefficient of rigidity)④彈性模量(modulus of elasticity)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 對體重的影響

如表1所示，與正常組相比，3個月后模型組最終體重及增重量大于正常組，差異具有顯著性，6個月后模型組最終體重及增重量大于正常組，差異不具有顯著性；與模型組比較，3個月與6個月后生長激素組與中藥組最終體重及增重量均無顯著性差異。故認為，補腎壯骨顆粒對快速老化雄性小鼠的體重變化無顯著性影響。

表1 各組小鼠體重變化Table 1 Weight change of mice in each group

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.2 骨生物力學性能

表2結(jié)果顯示，與正常組對比，3個月與6個月后模型組的股骨結(jié)構(gòu)力學參數(shù)均降低，差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)，表明模型組小鼠抗壓能力減弱，脆性增加，此結(jié)果符合快速老化雄性小鼠的生長特性；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組的股骨結(jié)構(gòu)力學參數(shù)均有提高，且差異具有顯著性(P<0.01)，6個月后生長激素組和中藥組的結(jié)構(gòu)力學參數(shù)亦均有提高，其中生長激素組彈性載荷、最大繞度和最大彎矩差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，中藥組最大載荷和彈性載荷差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與生長激素組對比，3個月后中藥組最大載荷、彈性載荷、最大繞度、能量吸收和最大彎矩均略有提高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，6個月后中藥組彈性載荷、最大繞度、最大彎矩及能量吸收降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3所示，與正常組對比，3個月后模型組材料力學參數(shù)均降低，其中剛性系數(shù)和極限強度差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)，6個月后模型組材料力學參數(shù)亦均有降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組材料力學參數(shù)均提高，其中兩組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力、剛性系數(shù)差異具有顯著性(P<0.05或P<0.01)，6個月后生長激素組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力、剛性系數(shù)有所提高，彈性模量有所降低，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，中藥組彈性應(yīng)力、剛性系數(shù)有所提高，彈性模量有所降低，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，最大應(yīng)力基本無改變；與生長激素組對比，3個月后中藥組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力提高，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，剛性系數(shù)和彈性模量降低，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，6個月后中藥組股骨材料力學參數(shù)均降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 各組骨結(jié)構(gòu)力學參數(shù)的結(jié)果Table 2 Results of mechanical parameters of bone structure in each group

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

表3 各組骨材料力學參數(shù)的結(jié)果Table 3 Results of mechanical parameters of bone materials in each group

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.3 股骨宏觀幾何結(jié)構(gòu)和皮質(zhì)骨面積

如表4和表5，與正常組對比，3個月和6個月后模型組股骨外徑及其橫截面積無顯著性差異，內(nèi)徑及其橫截面積增大，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積減小，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組股骨外徑、骨橫截面積增大，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，內(nèi)徑、骨髓腔橫截面積減小，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異有顯著性(P<0.01或P<0.05)，6個月后生長激素組外徑及其橫截面積增大，內(nèi)徑及其橫截面積減小，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異具有顯著性(P<0.01)，中藥組股骨外徑及其橫截面積增大，內(nèi)徑及其骨髓腔橫截面積減小，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)；與生長激素組對比，3個月后中藥組線性幾何量和幾何截面積無統(tǒng)計學意義差異(P>0.05)，6個月后中藥組外徑及其橫截面積增大，內(nèi)徑及其橫截面積減小，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，皮質(zhì)骨厚度及其橫截面積增大，差異具有顯著性(P<0.01)。

表4 各組骨線性幾何量的結(jié)果Table 4 Results of linear geometric figures of bone in each

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

表5 各組骨幾何截面積的結(jié)果Table 5 Results of geometric sectional area of bone in each

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.4 股骨截面的力學幾何量

如表6，與正常組對比，3個月后模型組股骨截面的力學幾何量降低，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，6個月后模型組股骨截面的力學幾何量有降低但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組股骨截面的力學幾何量均有所增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，6個月后生長激素組股骨截面的力學幾何量均有所增加，其中抗扭截面模數(shù)和抗彎截面模數(shù)具有統(tǒng)計學意義差異(P<0.05)，中藥組股骨截面的力學幾何量均增大，差異具有顯著性(P<0.01)；與生長激素組對比，3個月后中藥組股骨截面力學幾何量無差別，6個月后均有提高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表6 各組骨力學截面幾何量的結(jié)果Table 6 Results of geometric section of bone mechanics in each

注：與MG對比，*表示P<0.05,**表示P<0.01;與GHG對比，△表示P<0.05,△△表示P<0.01。

Note: Compared with MG,*meansP<0.05,**meansP<0.01; compared with GHG,△denotesP<0.05, and△△denotesP<0.01.

2.5 骨量

如表7，與正常組相比，3個月及6個月模型組骨礦密度持續(xù)降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與模型組對比，3個月后生長激素組和中藥組骨礦密度均降低，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，6個月后生長激素組和中藥組骨礦密度有所提高，但無統(tǒng)計學意義；與生長激素組對比，3個月和6個月后中藥組骨礦密度均提高，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表7 各組骨礦密度的結(jié)果Table 7 Results of bone mineral density in each

3 討論

快速老化型小鼠(senescence accelerated mouse,SAM)具有全身廣泛性骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)破壞，骨脆性增加，低峰值骨密度，低峰值骨量等特點，與人類老年性骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)相似，是研究老年性骨質(zhì)疏松癥的理想模型[6]。本次研究3月和6月后測得結(jié)果均顯示模型組SAMP6小鼠較同期正常組SAMR1小鼠骨量減少，骨生物力學性能下降，皮質(zhì)骨厚度減小，且SAMP6小鼠檢測結(jié)果6月較3月骨質(zhì)疏松癥更為明顯，符合此次老年男性骨質(zhì)疏松模型的研究標準。

中醫(yī)對骨質(zhì)疏松的記載最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“刺腰痛”專篇。根據(jù)骨質(zhì)疏松臨床表現(xiàn)及發(fā)病機制，當屬“骨痿”“骨痹”范疇?，F(xiàn)代中醫(yī)從辯證角度分析骨質(zhì)疏松，認為本病的病癥在于腎、脾、經(jīng)絡(luò)，其病機特點為腎脾虛和瘀血，腎虛是發(fā)病的根本，瘀血是重要原因[7]。補腎壯骨顆粒是綜合了補腎、健脾、祛瘀理念并結(jié)合臨床經(jīng)驗調(diào)配而成的中藥復方，方中淫羊藿、鹿角膠、龜甲膠、骨碎補、巴戟天補腎陽、強筋骨、祛風濕，山藥健脾和胃益腎，水蛭活血祛瘀止痛。諸藥合用共奏補腎壯骨、健脾和胃、活血祛瘀之功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，淫羊藿有降低破骨細胞活性、活躍成骨細胞的作用；鹿角膠、龜甲膠有強壯的作用，能增強組織細胞的再生過程，提高機體適應(yīng)性過程；巴戟天、骨碎補有調(diào)節(jié)性激素的作用，諸藥配合組成的補腎壯骨顆粒有改善下丘腦-垂體-性腺軸功能，抑制骨吸收，促進骨形成。生長激素可以通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸刺激成骨細胞的復制和骨基質(zhì)的合成，防治中老年男性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生。

大量文獻表明單純測定骨密度不能發(fā)現(xiàn)包括器官和組織水平的結(jié)構(gòu)特性信息，不能完全反映骨的力學完整性[8]。本研究顯示前3個月補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠的骨含量并未起到積極作用，反而使骨含量降低，但骨生物力學有著顯著性的改善，此結(jié)果也再次印證了單純依靠測定骨密度來評價治療骨質(zhì)疏松藥物療效的不科學性；結(jié)合3月和6月后骨線性幾何量的結(jié)果分析此現(xiàn)象，原因可能是補腎壯骨顆粒更多的促進SAMP6小鼠皮質(zhì)骨成骨細胞的形成，對松質(zhì)骨的影響較遲緩，使得股骨外徑增大，但骨質(zhì)空隙率改善不明顯，進而使直觀測量的骨礦密度降低；6個月后結(jié)果顯示補腎壯骨顆粒提高了SAMP6小鼠的骨含量，且高于生長激素組，說明長期服用補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠松質(zhì)骨有顯著性的改善且優(yōu)于生長激素，以上需對其骨微結(jié)構(gòu)的研究加以確定。對于骨質(zhì)疏松動物模型，任何治療最重要的目是改善骨的生物力學性能。骨生物力學是通過研究骨組織在外界作用下的力學特性和生物學效應(yīng)的特點，來反映骨量和骨內(nèi)在結(jié)構(gòu)以及骨組織的抗骨折能力的情況，是一種可評價各種對抗骨丟失措施的方法[9]。由骨生物力學性能結(jié)果得知，補腎壯骨顆粒治療3個月后能夠顯著性改善SAMP6小鼠的骨結(jié)構(gòu)力學性能(P<0.01或P<0.05)，提高最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力和剛性系數(shù)(P<0.05)；治療6個月后結(jié)構(gòu)力學和材料力學參數(shù)也有所提高，其中最大載荷和彈性載荷差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明隨著SAMP6小鼠年齡的增長，骨量丟失和骨脆性的加大，補腎壯骨顆粒在一定程度上可以改善SAMP6小鼠的股骨結(jié)構(gòu)連續(xù)性，增加骨質(zhì)韌性，增強骨強度，提高骨剛度及抗骨變性和骨折能力。兩個用藥組結(jié)果顯示，補腎壯骨顆粒對SAMP6小鼠的骨生物力學性能影響與生長激素干預(yù)結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即補腎壯骨顆粒在改善SAMP6小鼠的生物力學性能方面可以與生長激素相匹敵。

早期研究表明，人體骨骼在基本發(fā)育過程中，股骨的截面幾何結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)骨的外徑不斷增粗，骨髓腔直徑漸漸擴大，骨皮質(zhì)厚度和骨皮質(zhì)面積不斷增加，骨的截面幾何模量不斷增大，骨骼的穩(wěn)定性和力學強度大大增加，以適應(yīng)人體體重及活動增加的力學要求。骨的這種截面宏觀幾何結(jié)構(gòu)的變化是符合結(jié)構(gòu)力學原理(結(jié)構(gòu)分布離中心越遠，結(jié)構(gòu)力學性能越優(yōu))的生理結(jié)構(gòu)代償機制,即骨幾何結(jié)構(gòu)生物力學應(yīng)答調(diào)節(jié)機能。隨著年齡的增長和器官的老化進而導致骨生物力學應(yīng)答調(diào)節(jié)機能的減弱也是老年期骨生物力學性能下降的主要原因[10-11]。本次對SAMP6小鼠股骨截面幾何結(jié)構(gòu)的研究證明，補腎壯骨顆粒能夠改變SAMP6小鼠股骨內(nèi)外經(jīng)顯著性增加皮質(zhì)骨厚度，減小骨髓腔面積，增大皮質(zhì)骨面積，提高骨的截面慣性矩、抗彎截面模數(shù)、極慣性矩、抗扭截面模數(shù)(P<0.01或P<0.05)，且6個月后中藥組皮質(zhì)骨厚度和橫截面積較生長激素組有顯著性增大(P<0.01)，即補腎壯骨顆粒比生長激素更能促進或加強SAMP6小鼠的股骨宏觀幾何結(jié)構(gòu)的生物力學應(yīng)答調(diào)節(jié)機能，積極影響骨的生物力學性能。

綜上可推斷，補腎壯骨顆粒應(yīng)具有調(diào)節(jié)老年男性骨質(zhì)疏松癥患者的骨宏觀幾何結(jié)構(gòu)的力學應(yīng)答機能的功能，進而改善骨的生物力學性能，增強骨質(zhì)韌性，增加骨強度，提高抵抗外力變形和骨折的能力，其效果與生長激素相當，故可以考慮選擇價格便宜且安全的補腎壯骨顆粒替代價格昂貴且風險較大的生長激素對老年男性骨質(zhì)疏松癥的治療。