顏春魯 李盛華 郭愛(ài)軍 安方玉 劉永琦 宋敏 陳麗 王鵬 馬正民 牛彥強(qiáng)

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3. 蘭州理工大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的慢性代謝性骨病，起病比較隱匿[1]。尋找骨質(zhì)疏松的防治方法成為醫(yī)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。根據(jù)中醫(yī)學(xué)“腎主骨生髓”的理論，參照藤黃健骨膠囊的方劑組成(熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉、淫角藿、雞血藤、萊菔子)，我們推測(cè)藤黃健骨膠囊的補(bǔ)腎強(qiáng)骨活血作用有可能影響骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨代謝。鑒于此，我們采用去卵巢法建立骨質(zhì)疏松大鼠模型，通過(guò)觀察其骨代謝生化指標(biāo)，骨質(zhì)微結(jié)構(gòu)及骨密度等指標(biāo)的變化，揭示藤黃健骨膠囊防治骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，為藤黃健骨膠囊的臨床應(yīng)用和后續(xù)開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)SD雌性大鼠，體重(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.1.2主要試劑

水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20150105)； Rat trACP ELISA Kit檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：E20151102B)；Rat BGP ELISA Kit檢測(cè)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：E20151201A)。

1.1.3主要儀器

iMark型自動(dòng)酶標(biāo)分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；FA2004 N型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；ZY12306型微量加樣器(ScienTiFic產(chǎn)品)；T6新悅-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TDZ5-WS型醫(yī)用離心機(jī)(湖南平凡科技有限公司)；雙能X骨密度儀(GE公司，美國(guó))；AG-IX生物力學(xué)萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)藥物及給藥劑量

藤黃健骨膠囊(甘肅省西峰制藥有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20123001，批號(hào)：503010)，人的臨床用量為：2 g/d，按照人與大鼠的體表面積換算法：2 g×0.018×5≈0.18 g/kg，作為中劑量。則藤黃健骨膠囊高、中、低劑量分別為0.36、0.18、0.09 g/kg；西藥對(duì)照組藥物為戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20130009，批號(hào)：156 A)；青霉素(華北制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H13020657，批號(hào)：F6042103)。

1.2.2動(dòng)物分組、造模及給藥

參照文獻(xiàn)[2]，4%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉動(dòng)物體重，俯臥位，備皮，消毒手術(shù)區(qū)皮膚。沿背部后正中線作一1.0-1.5 cm的縱形切口乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)中找到棕黃色的卵巢，沿子宮角處結(jié)扎并切除卵巢，逐層縫合傷口。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢周圍脂肪，其含量與卵巢重量一致。術(shù)后給予青霉素抗感染，大鼠術(shù)后注意保溫。造模成功12 w后，將SPF級(jí)SD雌性大鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、西藥對(duì)照組(戊酸雌二醇片組)、藤黃健骨膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只，另設(shè)假手術(shù)組10只。給予藥物干預(yù)，西藥對(duì)照組給予雌激素戊酸雌二醇片(0.09 mg/kg)灌胃治療，藤黃健骨膠囊藥物干預(yù)組按高、中、低劑量(0.36、0.18、0.09 g/kg)灌胃治療，假手術(shù)組和模型組大鼠給予等體積蒸餾水灌胃，每日1次，連續(xù)4周[3,4]。

1.2.3指標(biāo)測(cè)定

(1)動(dòng)物一般狀況觀察：觀察并記錄各組大鼠體重，精神狀態(tài)，毛發(fā)，活動(dòng)，飲食飲水，大小便等。

(2)骨代謝相關(guān)血清生化指標(biāo)測(cè)定：末次給藥后，腹主動(dòng)脈采血，靜置2-3 h，1500 rpm/min，離心10 min，分離血清。檢測(cè)各組動(dòng)物血清骨鈣素(osteocalcin，BGP)，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，trACP)等指標(biāo)。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(3)骨密度的測(cè)定：末次給藥結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組動(dòng)物，四肢展開(kāi)平置于雙能X 線吸收測(cè)量?jī)x平臺(tái)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)中小動(dòng)物軟件測(cè)定右股骨部位骨密度(bone mineral density，BMD)。

(4)骨生物力學(xué)檢測(cè)：處死大鼠后取出完整股骨，將其右側(cè)股骨送至陸軍總院，用AG-IX生物力學(xué)萬(wàn)能實(shí)驗(yàn)機(jī)檢測(cè)最大載荷和斷裂載荷等相應(yīng)指標(biāo)。

(5)HE染色觀察骨形態(tài)學(xué)變化：動(dòng)物處死后取完整股骨，對(duì)左側(cè)股骨脫鈣處理并脫蠟至水，蒸餾水2-5 min，蘇木精30 min，1%鹽酸乙醇20sec，自來(lái)水沖洗。1%伊紅復(fù)染后蒸餾水沖洗30sec。脫水、封片、鏡檢。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)及體重結(jié)果

與假手術(shù)組比較，模型組及各干預(yù)組大鼠皮毛欠光滑，其他一般狀況(精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食飲水、大小便)均未見(jiàn)明顯異常。與模型組對(duì)比，西藥對(duì)照組及藤黃健骨膠囊各干預(yù)組精神狀態(tài)、活動(dòng)、飲食飲水、大小便均無(wú)差異。與假手術(shù)組比較，模型組及給藥組大鼠體重均明顯升高(P<0. 05)；與模型組比較，藤黃健骨膠囊高劑量組體重顯著降低(P<0. 05)；藤黃健骨膠囊低、中劑量組和西藥對(duì)照組體重較模型組降低，但無(wú)顯著差異。見(jiàn)表1。

表1 藤黃健骨膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠末次給藥后體重的影響Table 1 Effect of gamboge strong-bone capsule on the weight of ovariectomized rats after the last drug given

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.2 對(duì)骨代謝相關(guān)血清生化指標(biāo)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清BGP含量顯著降低，trACP含量顯著升高(P<0. 05)；與模型組比較，藤黃健骨膠囊各干預(yù)組和西藥對(duì)照組血清BGP含量含量均顯著升高，藤黃健骨膠囊高劑量組血清trACP含量明顯降低(P<0. 05)。見(jiàn)表 2。

表2 藤黃健骨膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of gamboge strong-bone capsule on the serum biochemical indices in ovariectomized rats

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.3 對(duì)骨密度的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠BMD顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，藤黃健骨膠囊各干預(yù)組和西藥對(duì)照組BMD均顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 藤黃健骨膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨密度的影響Table 3 Effect of gamboge strong-bone capsule on bone mineral density in ovariectomized rats

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.4 對(duì)骨生物力學(xué)參數(shù)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠股骨的結(jié)構(gòu)力學(xué)參數(shù)如最大載荷、斷裂載荷等均明顯下降(P<0.05)；藤黃健骨膠囊各干預(yù)組和西藥對(duì)照組可明顯改善去卵巢大鼠斷裂載荷參數(shù)，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和西藥對(duì)照組可明顯改善去卵巢大鼠最大載荷參數(shù)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 藤黃健骨膠囊對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨生物力學(xué)的影響Table 4 Effect of gamboge strong-bone capsule on biomechanical properties of the femur in

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

2.5 股骨骨形態(tài)學(xué)影響

假手術(shù)組大鼠可見(jiàn)骨小梁排列規(guī)則、緊密、有序、結(jié)構(gòu)完整、呈網(wǎng)狀，密度、面積正常，骨小梁間隙較??；模型組大鼠可見(jiàn)骨小梁排列不規(guī)則，數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)稀疏，骨小梁丟失、斷裂嚴(yán)重，骨小梁之間連接點(diǎn)較少，分布稀疏凌亂，間距增大；藤黃健骨膠囊高劑量組和西藥對(duì)照組大鼠骨小梁明顯增粗，排列尚整齊并連接成網(wǎng)，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大。見(jiàn)圖1。

圖1 股骨病理形態(tài)學(xué)變化(HE，100×)Fig.1 The pathomorphological changes of the femur (HE, 100×)

3 討論

大多數(shù)骨質(zhì)疏松癥患者為絕經(jīng)后女性，其特點(diǎn)是雌激素水平下降[5]。目前，骨質(zhì)疏松的經(jīng)典治療仍然選用激素替代療法，西藥戊酸雌二醇片是補(bǔ)充或替代雌激素分泌不足的一種處方藥，主要用于由自然或人工絕經(jīng)導(dǎo)致的雌激素缺乏病，但長(zhǎng)期使用雌激素易增加患者患乳腺癌、子宮出血、心血管系統(tǒng)疾病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。而中藥治療骨質(zhì)疏松，具有安全、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[7]。

中醫(yī)將骨質(zhì)疏松歸屬于“骨痿”“骨痹”等范疇。中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，主骨生髓，腎精虧虛，骨髓生化無(wú)源，骨骼失養(yǎng)，發(fā)生骨折，認(rèn)為腎虛是造成骨病的主要原因[8]，故治則以補(bǔ)腎為主。方中熟地黃滋補(bǔ)腎陰，骨碎補(bǔ)、肉蓯蓉和淫羊藿補(bǔ)腎助陽(yáng)，鹿銜草和雞血藤補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨。諸藥合用，具有補(bǔ)腎，活血，止痛的功效。

骨代謝生化指標(biāo)中的骨形成標(biāo)志物和骨吸收標(biāo)志物能夠動(dòng)態(tài)地反映骨代謝情況。骨鈣素(BGP)主要由成骨細(xì)胞合成并分泌，在骨形成受到抑制時(shí)BGP會(huì)降低，是評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換率的特異性指標(biāo)[9]?？咕剖崴嵝粤姿崦?trACP)可由破骨細(xì)胞釋放后進(jìn)入血循環(huán)，骨吸收活躍時(shí)trACP會(huì)升高，是反映骨吸收的特異性指標(biāo)[10]。本實(shí)驗(yàn)藤黃健骨膠囊各干預(yù)組和西藥對(duì)照組血清BGP含量較模型組均顯著升高，而藤黃健骨膠囊高劑量組血清StrACP 含量較模型組顯著降低，提示藤黃健骨膠囊可影響骨代謝，其機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)骨形成、增強(qiáng)骨轉(zhuǎn)化，抑制骨吸收實(shí)現(xiàn)的。

骨組織骨量、結(jié)構(gòu)、形狀及內(nèi)在的生物力學(xué)等指標(biāo)對(duì)骨組織的強(qiáng)度起決定作用[11]。骨密度(BMD)可以反映骨質(zhì)量和骨強(qiáng)度，是一種可預(yù)測(cè)骨折危險(xiǎn)性的敏感指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)藤黃健骨膠囊各干預(yù)組和西藥對(duì)照組BMD明顯增加，提示藤黃健骨膠囊可有效降低骨質(zhì)疏松癥骨折的發(fā)生率，其機(jī)制可能是通過(guò)增加BMD實(shí)現(xiàn)的。骨生物力學(xué)主要是研究骨組織在外界作用下的力學(xué)性能和骨在受力后的所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，是評(píng)價(jià)藥物對(duì)骨質(zhì)量的指標(biāo)[13]，骨量的減少以及骨質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變均能影響骨生物力學(xué)，可降低生物力學(xué)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤黃健骨膠囊各干預(yù)組和西藥對(duì)照組斷裂載荷參數(shù)較模型組明顯升高；與此同時(shí)，藤黃健骨膠囊中、高劑量組和西藥對(duì)照組最大載荷參數(shù)較模型組也明顯升高，提示藤黃健骨膠囊通過(guò)改善骨生物力學(xué)的性能來(lái)防治骨質(zhì)疏松。

骨的病理形態(tài)學(xué)觀察是反映骨質(zhì)疏松的病理組織狀況的客觀指標(biāo)[3]。摘除女性卵巢后，骨的重建會(huì)加快，骨質(zhì)丟失嚴(yán)重，骨小梁變薄，連接性中斷、間隙變大，引發(fā)骨質(zhì)疏松癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，藤黃健骨膠囊高劑量組和西藥對(duì)照組大鼠與模型組比較，骨小梁明顯增粗，排列尚整齊并連接成網(wǎng)，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大，說(shuō)明藤黃健骨膠囊通過(guò)改善或修復(fù)骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)防治骨質(zhì)疏松。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了成年雌性SD大鼠卵巢切除后，BMD、BGP、最大載荷和斷裂載荷等指標(biāo)均明顯降低，trACP含量明顯升高，使骨吸收大于骨形成，造成骨代謝失平衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生。而藤黃健骨膠囊具有類雌激素的作用，可以拮抗上述骨質(zhì)疏松的相關(guān)指標(biāo)來(lái)發(fā)揮保護(hù)骨組織的作用。該研究結(jié)果為藤黃健骨膠囊治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制提供了理論依據(jù)。