吳麗婷 蔡勁薇 潘吉銘 伍龍果 梁敏

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科, 廣西 南寧 530021

隨著糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為了最常見(jiàn)的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，以骨量快速丟失及骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征[1-2]。風(fēng)濕病患者使用糖皮質(zhì)激素治療后骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增高[3-4]，使用超生理劑量糖皮質(zhì)激素治療超過(guò)90天的患者骨密度(bone mineral density, BMD)明顯下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加[5]。研究認(rèn)為在使用糖皮質(zhì)激素初期，患者骨量丟失及骨折風(fēng)險(xiǎn)較長(zhǎng)期持續(xù)使用糖皮質(zhì)繼續(xù)的患者高[6]，另一項(xiàng)對(duì)使用吸入性糖皮質(zhì)激素治療≥1年的兒童與成人哮喘患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者骨密度和骨折風(fēng)險(xiǎn)并無(wú)增加[7]。目前關(guān)于糖皮質(zhì)激素應(yīng)用劑量及療程對(duì)骨骼代謝的影響尚有爭(zhēng)議，本研究通過(guò)探討不同劑量地塞米松干預(yù)不同時(shí)間對(duì)大鼠全身BMD及成骨細(xì)胞骨形成的作用，來(lái)闡明糖皮質(zhì)激素劑量、療程對(duì)骨代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

3月齡雌性SPF級(jí)SD大鼠120只，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)：SYXK 桂 2014-0003， 體質(zhì)量210～250 g。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(生理鹽水組)、小劑量Dex組(Dex 1 mg/kg組)、中劑量Dex組(Dex 2.5 mg/kg組)、高劑量Dex組(Dex 5 mg/kg),每組30只。對(duì)照組肌內(nèi)注射生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組分別肌內(nèi)注射1 mg/kg、2.5 mg/kg、5 mg/kg的Dex,左右肢交替注射，2次/周，分別干預(yù)4 w、9 w、12 w。廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，溫度(22±1) ℃，濕度59%～61%，日夜晝律為12 h，自由攝食進(jìn)水。

1.2 骨密度測(cè)定

使用PLODIGY型(Lunar公司)雙能X線(xiàn)骨密度儀附帶的小動(dòng)物軟件測(cè)定大鼠骨密度。干預(yù)前及干預(yù)后4 w、9 w、12 w，腹腔注射10%的水合氯醛3 mL/kg麻醉后測(cè)定大鼠全身骨密度。

1.3 免疫組化法檢測(cè)骨組織ALP、I型膠原蛋白表達(dá)

干預(yù)4 w、9 w、12 w后處死大鼠，快速取右側(cè)股骨近干骺端1/3部分，4%多聚甲醛(含1‰DEPC)固定24 h，每周2次更換10%EDTA脫鈣液，共6周。脫鈣結(jié)束后免疫組化SABC法檢測(cè)ALP蛋白表達(dá)，顯微鏡(OLYMPUS BX53)下觀察并選取3個(gè)視野，使用Image-ProPlus 圖像分析系統(tǒng)分析陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)情況，并計(jì)算平均光密度值。

1.4 成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定

出生24 h的SD大鼠乳鼠(廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)顱骨中提取成骨細(xì)胞，采用酶消化法提取原代成骨細(xì)胞，差速粘附法去除成纖維細(xì)胞。分離的成骨細(xì)胞24 h貼壁生長(zhǎng)，倒置顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞呈紡錘形，多邊形，長(zhǎng)梭形，包漿豐富，核仁清晰，含有1個(gè)明顯核仁，有數(shù)個(gè)細(xì)胞突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，成骨細(xì)胞規(guī)律性排列，呈放射性生長(zhǎng)，符合成骨細(xì)胞的形態(tài)。采用堿性磷酸酶重氮鹽染色法鑒定成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有棕黑色細(xì)微顆粒，細(xì)胞陽(yáng)性率95%，用PBS 代替底物的陰性對(duì)照中的細(xì)胞內(nèi)無(wú)黑色顆粒。采用茜素紅染色法鈣結(jié)節(jié)結(jié)果提示分離的成骨細(xì)胞經(jīng)茜素紅染色呈橙紅色。通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)染色，證明分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的形態(tài)特征和分泌堿性磷酸酶、形成鈣結(jié)節(jié)的生物學(xué)行為。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理

純化的原代成骨細(xì)胞按每毫升2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種96孔板，每孔100 μL，設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，并加入含有不同濃度(5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L)Dex的培養(yǎng)液100 μL干預(yù)成骨細(xì)胞12 h、24 h、48 h，對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)液，空白組加入等量的PBS，一般位于96孔板的4 w。

1.6 CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖

培養(yǎng)結(jié)束時(shí)每孔加入cck8 10 μL，37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育1 h后用酶標(biāo)儀測(cè)每孔的吸光值，空白組一般設(shè)為96孔培養(yǎng)板四周的PBS孔。避光孵育1 h后，將孔板置于酶標(biāo)儀上，選擇450 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸收度，結(jié)果用A450表示。計(jì)算時(shí)將每個(gè)Dex藥物濃度組細(xì)胞的6個(gè)復(fù)孔值去掉一個(gè)最大數(shù)值，去掉一個(gè)最小數(shù)值，剩余的4個(gè)數(shù)值取平均值表示該Dex藥物干預(yù)組的吸光值。

1.7 RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞ALP和I型膠原基因的表達(dá)

純化的成骨細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后，Trizol Reagent(美國(guó)Invitrogen 公司)提取細(xì)胞總RNA。采用一步法RT-PCR 試劑盒(日本Takara 公司)檢測(cè)細(xì)胞ALP mRNA 表達(dá)。內(nèi)參β-actin 和ALP 序列為:

ALP 上游序列：CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA；

下游序列：CCTTGTAACCAGGCCCGTTG，擴(kuò)增長(zhǎng)度158 bp。

I型膠原 上游序列：GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC；

下游序列：GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA，擴(kuò)增長(zhǎng)度119 bp。

β-actin 上游序列：GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG

下游序列：ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，擴(kuò)增長(zhǎng)度143 bp。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15S，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。

1.8 主要試劑

地塞米松磷酸鈉注射液(1 mL∶ 5 mg，廣東三才石岐制藥有限公司)，大鼠麻醉劑(10% 的水合氯醛)，地塞米松(Sigma),焦炭酸二乙酯(DEPC)，Trizol (Invitrogen 公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)，DreamTaq Green PCR Master Mix (TaKaRa寶生物公司)，免疫組化染色試劑盒(KIT-7720，邁新)，CCK8試劑盒(日本同仁)。PCR 引物: 根據(jù)Gene Bank 中大鼠ALP、I型膠原(內(nèi)參) 的基因序列設(shè)計(jì)引物，由寶生物工程(大連) 有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Dex對(duì)大鼠骨密度的影響

干預(yù)4 w，不同劑量Dex 組大鼠全身BMD與對(duì)照組相比均無(wú)差異(P>0.05)。干預(yù)9 w，不同劑量Dex 組大鼠全身BMD均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組大鼠BMD明顯低于小劑量組(P<0.05)。干預(yù)12 w，不同劑量Dex 組大鼠BMD均低于對(duì)照組(P<0.05)，高劑量組BMD明顯低于中劑量和小劑量組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同劑量地塞米松組大鼠干預(yù)前后全身骨密度的比較Table 1 Comparison of BMD among the four groups before and after Dex intervention g/cm2)

注：▲與對(duì)照組相比P<0.05，#與高劑量組比較,P<0.05。

2.2 Dex對(duì)骨組織ALP和I型膠原蛋白表達(dá)的影響

干預(yù)4 w，不同劑量Dex 組大鼠骨組織ALP與I型膠原蛋白表達(dá)與對(duì)照組均無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1。干預(yù)9 w，小劑量Dex組大鼠骨組織I型膠原蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)，ALP蛋白表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05)；中劑量和高劑量Dex 組骨組織的ALP及I型膠原蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。干預(yù)12 w，不同劑量Dex組大鼠骨組織ALP及I型膠原蛋白表達(dá)均明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，高劑量Dex 組骨組織的ALP、I型膠原蛋白表達(dá)顯著低于中劑量和小劑量組(P<0.05),見(jiàn)圖3。

2.3 Dex對(duì)體外分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖的影響

分別采用5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L Dex作用于成骨細(xì)胞12 h、24 h及48 h。干預(yù)12 h，與空白對(duì)照組比較，5×10-6mol/L和5×10-5mol/L Dex均抑制成骨細(xì)胞的增殖(P<0.05)，見(jiàn)表2；干預(yù)24 h及48 h后，不同濃度Dex均抑制成骨細(xì)胞的增殖(P<0.05)，干預(yù)同一時(shí)間，成骨細(xì)胞增殖率隨著Dex濃度的增加而下降，呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表2；同一濃度Dex作用下，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，成骨細(xì)胞增殖率逐漸下降，呈時(shí)間依賴(lài)性，見(jiàn)圖4。

圖1 干預(yù)4 w后ALP、I型膠原蛋白在不同劑量Dex組的表達(dá)(×200)Fig.1 Expression of ALP and type I collagen protein in different groups after treated with Dex for 4 weeks (×200).

圖2 干預(yù)9 w后ALP、I型膠原蛋白在不同劑量Dex組的表達(dá)(×200)Fig.2 Expression of ALP and type I collagen protein in different groups after treated with Dex for 9 weeks (×200).

圖3 干預(yù)12 w后ALP、I型膠原蛋白在不同劑量Dex組的表達(dá)(×200)Fig.3 Expression of ALP and type I collagen protein in different groups after treated Dex for 12 weeks (×200).

表2 不同濃度的Dex干預(yù)不同時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of different concentrations of Dex on osteoblast proliferation in different courses.

注：*表示同一作用時(shí)間點(diǎn)的不同濃度地塞米松藥物與空白對(duì)照比較，P<0.05。

圖4 不同濃度的Dex干預(yù)不同時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞增殖率的變化Fig.4 Effect of different concentrations of Dex on osteoblast proliferation in different courses.

圖5 不同濃度Dex干預(yù)不同時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)的影響(與對(duì)照組相比)Fig.5 Effect of different concentrations of Dex on the expression of ALP mRNA in different courses (compared with the control group).

圖6 不同濃度的Dex干預(yù)不同時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞骨形成指標(biāo) I型膠原mRNA表達(dá)的影響(與對(duì)照組相比)Fig.6 Effect of different concentrations of Dex on the expression of type I collagen mRNA in different courses (compared with the control group)

2.4 Dex對(duì)體外分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞ALP、I型膠原 mRNA表達(dá)的影響

分別采用5×10-5mol/L、5×10-6mol/L、5×10-7mol/L、5×10-8mol/L Dex作用于成骨細(xì)胞12 h,24 h及48 h。干預(yù)12 h，與對(duì)照組相比，5×10-8mol/L Dex組成骨細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異(P>0.05)；隨著Dex濃度的增加，ALP mRNA的表達(dá)逐漸降低(P<0.05)，以5×10-5mol/L Dex組的成骨細(xì)胞ALP mRNA下降最明顯(P<0.001)，呈濃度依賴(lài)性,見(jiàn)圖5；干預(yù)12 h，與對(duì)照組相比，5×10-5mol/L Dex組成骨細(xì)胞I型膠原mRNA表達(dá)低于對(duì)照組(P<0.05),其余濃度Dex組與對(duì)照組比較均無(wú)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖6。干預(yù)24 h及48 h,不同濃度Dex組成骨細(xì)胞ALP、I型膠原 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)，在同一干預(yù)時(shí)間隨著Dex的濃度增加，ALP及I型膠原 mRNA的表達(dá)逐漸降低(P<0.05),呈濃度依賴(lài)性，見(jiàn)圖5～6。進(jìn)一步觀察Dex作用時(shí)間對(duì)ALP、I型膠原mRNA的影響，除5×10-8mol/L Dex組外，其他濃度Dex組均隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，ALP及I型膠原 mRNA的表達(dá)均逐漸降低，以48 h時(shí)間點(diǎn)的抑制作用最強(qiáng)，呈時(shí)間依賴(lài)性(見(jiàn)圖7～8)。

圖7 同一濃度Dex干預(yù)不同時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞ALP mRNA表達(dá)的影響(*表示與對(duì)照組比較，P<0.05)Fig.7 Effect of the same concentration of Dex on the expression of ALP mRNA in different courses (*：Compared with the control group, P<0.05).

圖8 同一濃度的Dex干預(yù)不同的時(shí)間對(duì)成骨細(xì)胞 I型膠原mRNA表達(dá)的影響(*表示與對(duì)照組比較，P<0.05)Fig.8 Effect of the same concentration of Dex on the expression of type I collagen mRNA (*： Compared with the control group, P<0.05)

3 討論

GIOP作為第一位醫(yī)源性所致的骨質(zhì)疏松[8]，可致骨量減少和骨微結(jié)構(gòu)破壞，易發(fā)生脆性骨折[9]。糖皮質(zhì)激素應(yīng)用的劑量、時(shí)間、給藥方式等均可能會(huì)對(duì)骨骼有不同影響，研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性硬化癥患者短期內(nèi)應(yīng)用大劑量糖皮質(zhì)激素并未出現(xiàn)骨密度降低[10]，長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可導(dǎo)致骨吸收增加及骨形成減少，加快骨量丟失，出現(xiàn)骨密度下降[11]。本課題組前期以2.5 mg/kg Dex每周2次肌注，4 w后不同劑量Dex組大鼠骨密度與對(duì)照組相比無(wú)差異，9 w后各組大鼠骨密度均下降[12]。Ogoshi等[13]分別使用2 mg/(kg·d)及20 mg/(kg·d)的潑尼松龍對(duì)3月齡大鼠干預(yù)4 w，結(jié)果顯示大鼠的骨小梁及皮質(zhì)骨BMD并未下降。本研究結(jié)果也顯示，Dex干預(yù)4 w內(nèi)大鼠全身骨密度并未下降，骨形成無(wú)減少，這與本課題組前期發(fā)現(xiàn)是一致的[14]，說(shuō)明短期內(nèi)Dex對(duì)大鼠的骨形成并未產(chǎn)生抑制作用，全身骨量無(wú)明顯丟失。糖皮質(zhì)激素對(duì)骨代謝影響有著強(qiáng)烈的時(shí)間、劑量依賴(lài)性[15]，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各劑量Dex均可導(dǎo)致大鼠全身BMD下降，骨形成明顯減少，高劑量Dex 導(dǎo)致骨密度下降幅度及對(duì)骨形成的抑制作用均明顯強(qiáng)于小劑量及中劑量Dex，本研究結(jié)果也表明糖皮質(zhì)激素對(duì)骨形成及骨密度影響呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性，長(zhǎng)期及大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素對(duì)骨形成抑制作用更強(qiáng)，骨密度明顯下降。這也與“糖皮質(zhì)激素并沒(méi)有最低的安全劑量”觀點(diǎn)是相符合的[16]。

有研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素可抑制成骨細(xì)胞增殖[17]，在10-9mol/L～10-5mol/L Dex干預(yù)24 h后，成骨細(xì)胞增殖隨著濃度的增加而減少[18]；國(guó)內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)使用不同濃度Dex(10- 7mol/L、5×10- 8mol/L、10- 8mol/L)培養(yǎng)成骨細(xì)胞96 h后，在5×10- 8mol/L 和10- 7mol/L 濃度的Dex可抑制成骨細(xì)胞骨鈣素基因表達(dá)和細(xì)胞增殖[19]。 在高濃度Dex作用下，成骨細(xì)胞的成脂活性增強(qiáng)，成骨細(xì)胞的增殖、骨形成活性明顯受到抑制[20]。本研究結(jié)果與上述研究相似，僅干預(yù)12 h，最低濃度(5×10-8mol/L) Dex對(duì)成骨細(xì)胞增殖及骨形成并無(wú)抑制作用，但高濃度(5×10-5mol/L)Dex可抑制成骨細(xì)胞的增殖及骨形成；Dex干預(yù)24 h后，成骨細(xì)胞增殖和ALP、I型膠原mRNA 表達(dá)均呈濃度依賴(lài)性降低，表明短期內(nèi)低劑量的Dex對(duì)成骨細(xì)胞增殖及骨形成未產(chǎn)生抑制作用，但隨著劑量和時(shí)間的增加，Dex 對(duì)成骨細(xì)胞增殖及骨形成的抑制作用越來(lái)越強(qiáng)。而研究也發(fā)現(xiàn)，使用10-9mol/L～10-6mol/L濃度Dex干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，ALP活性隨著時(shí)間和濃度的增加越來(lái)越低，在干預(yù)最長(zhǎng)時(shí)間及最高濃度時(shí)骨形成作用最弱[21]，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性地抑制成骨細(xì)胞增殖及骨形成作用。

綜上所述，短時(shí)間、小劑量的Dex 對(duì)大鼠骨密度和骨形成無(wú)不良影響，但長(zhǎng)期、高劑量的Dex可明顯抑制成骨細(xì)胞增殖和骨形成，降低骨密度，導(dǎo)致了糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的發(fā)生。