梁學(xué)振許波李剛蓋帥帥閻博昭李嘉程夏聰敏

山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)異常及骨脆性增加為特征的全身性代謝性骨病[1-2]。目前，防治OP的主要手段包括藥物干預(yù)、飲食調(diào)控和運(yùn)動(dòng)療法。西藥通常包括骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和骨礦化物等三大類[3]，但往往局限于改善臨床癥狀，延緩病情進(jìn)展且靶向性不強(qiáng)，因此亟需探尋新的思路解決上述問題[4]。中醫(yī)藥在辯證論治原則的指導(dǎo)下結(jié)合分期治療在防治OP方面取得了顯著的療效[5-7]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，補(bǔ)腎活血類中藥不但可以提高腸鈣吸收、促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化、增強(qiáng)細(xì)胞成骨性活性、抑制破骨細(xì)胞的形成等綜合功效[8-9]，而且與西藥單向調(diào)控機(jī)制相比，治療調(diào)控存在雙向化，調(diào)節(jié)效應(yīng)更具優(yōu)勢[10]。

補(bǔ)腎活血膠囊是山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科名中醫(yī)李剛教授在多年的臨床實(shí)踐中，結(jié)合中醫(yī)學(xué)“腎主骨生髓”的經(jīng)典理論歸納總結(jié)而成，其主要成分為鹿角膠、丹參、川芎、杜仲、淫羊藿、香附、白芍、茯苓、牛膝、甘草，諸藥合用共奏補(bǔ)腎壯筋，活血止痛之功。臨床研究表明[11-13]，補(bǔ)腎活血膠囊對于OP具有較好的臨床療效，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制至今尚不明確。因此，挖掘補(bǔ)腎活血膠囊的入血活性成分和作用靶點(diǎn)，分析其可能的作用機(jī)制，對于補(bǔ)腎活血膠囊的科學(xué)內(nèi)涵的闡述和其臨床推廣應(yīng)用具有重要的促進(jìn)作用。目前針對中藥復(fù)方方面的研究僅僅通過現(xiàn)有的手段往往具有檢測靈敏度低、可靠評價(jià)指標(biāo)少等問題而難以科學(xué)、有效、全面地闡釋其作用機(jī)制。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)理論的建立，為研究中藥復(fù)方潛在活性成分和作用靶點(diǎn)提供了有效的研究策略。本文通過藥物口服生物利用度(oral bio-availability，OB)、藥物相似性(drug-likeness，DL)等參數(shù)對補(bǔ)腎活血膠囊中已報(bào)道的所有成分進(jìn)行系統(tǒng)的篩選以預(yù)測其可能靶點(diǎn)，同時(shí)檢索疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫和分析GEO芯片挖掘與骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的已知與潛在的靶點(diǎn)，借助網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅氖侄?，進(jìn)一步預(yù)測補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的作用靶點(diǎn)，對靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，探討其可能的作用機(jī)制。

1 方法

1.1 補(bǔ)腎活血膠囊中活性成分的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)中收錄了約505味中藥和約12144相關(guān)中藥成分，并詳細(xì)地描述了每一個(gè)成分的毒藥物動(dòng)力學(xué)(absorption and distribution and metabolism and excretion, ADME)參數(shù)，包括OB、DL、Caco-2細(xì)胞滲透性、半衰期、血腦屏障、脂水分布系數(shù)等。本研究通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫對補(bǔ)腎活血膠囊所有成分進(jìn)行初步篩選，其中篩選條件為 OB≥30%，DL≥0.18；同時(shí)，將獲取的活性成分與前期研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合分析，并采用 TCMSP 靶點(diǎn)預(yù)測模型預(yù)測相關(guān)活性成分可能的作用靶點(diǎn)。

1.2 補(bǔ)腎活血膠囊“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建

本研究通過網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件 Cytoscape 3.2.1進(jìn)行補(bǔ)腎活血膠囊“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”的構(gòu)建和分析，將上述獲得的活性成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入軟件進(jìn)行相關(guān)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，其中用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示分子、靶蛋白，用“邊”(edge)表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系；采用network analyzer插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)特征分析以明確補(bǔ)腎活血膠囊中較為重要的成分和靶點(diǎn)，同時(shí)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)以分析其中的相互作用。

1.3 GEO 芯片數(shù)據(jù)分析OP相關(guān)靶點(diǎn)

從GeneExpression Omnibus數(shù)據(jù)庫中下載編號為：GSE7429的芯片數(shù)據(jù)原始文件，該芯片數(shù)據(jù)的原始文件主要針對20位絕經(jīng)后骨密度(bone mineral density, BMD)高低不同女性血液的基因表達(dá)譜的基因測序，其中低BMD10個(gè)和高BMD10個(gè)。本研究利用robust multiarray average(RMA)算法對其原始文件進(jìn)行了背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理，同時(shí)采用limma包對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行二次分析，并結(jié)合P值和差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)進(jìn)行相關(guān)數(shù)值的篩選，其中將P<0.01，F(xiàn)C>1.5作為顯著差異基因的篩選條件。

1.4 已知的OP相關(guān)疾病靶點(diǎn)檢索

在TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、GAD和PharmGKB等5個(gè)數(shù)據(jù)庫中利用“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行已知的疾病靶點(diǎn)的檢索及篩選。刪除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點(diǎn)以獲得OP發(fā)病過程已知的靶點(diǎn)。

1.5 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

本研究將補(bǔ)腎活血膠囊上述的作用靶點(diǎn)和OP相關(guān)的疾病靶點(diǎn)分別映射到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中，利用BisoGenet插件對2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制，將繪制得到的2個(gè)蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖采用cytoscape進(jìn)行合并，抽取其交集網(wǎng)絡(luò)，即為補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的直接和間接靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

跟蹤相關(guān)文獻(xiàn)并借助自由度、中心中介性、特征向量中心性、緊密度、網(wǎng)絡(luò)中心性和局部邊連通性等指標(biāo)，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮﨏ytoNCA篩選出自由度大于所有節(jié)點(diǎn)自由度中位數(shù)2倍的節(jié)點(diǎn)(Big hubs)；然后，篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)再篩選其他幾個(gè)指標(biāo)大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即關(guān)鍵基因。上述獲得的相關(guān)活血成分及靶點(diǎn)則有可能是直接、間接調(diào)控這些節(jié)點(diǎn)，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。

1.6 Pathway 富集分析

本研究采用ClueGO分析插件對上述OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)及獲得的信號通路進(jìn)行富集分析，并根據(jù)重要程度繪制信號通路占比餅狀圖；其中ClueGO展示的圖像中同一種顏色的節(jié)點(diǎn)代表同一類型的信號通路，節(jié)點(diǎn)的大小代表了該信號通路的顯著性，信號通路的顯著性越高節(jié)點(diǎn)越大，說明該通路的重要性越高。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎活血膠囊活性成分篩選與ADME分析

本研究通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫補(bǔ)腎活血膠囊中所有的已報(bào)道的成分及其 ADME參數(shù)共搜集到1 186個(gè)相關(guān)成分。根據(jù)OB和DL參數(shù)共篩選出249個(gè)入血的活性成分(圖 1)。利用相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測技術(shù)對上述活性成分進(jìn)行作用靶點(diǎn)預(yù)測，排除重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得145個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)。

圖1 根據(jù)ADME參數(shù)篩選出的補(bǔ)腎活血膠囊活性成分分布圖。A： 符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)腎活血膠囊成分；B： 符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)腎活血膠囊各藥成分比例Fig.1 ADME parameters distribution of active ingredients in BuShenHuoXue capsule. A： Components that meet the criteria for screening in BuShenHuoXue capsule; B： Component ratio in accordance with the screening conditions in each herb in BuShenHuoXue capsule

圖2 補(bǔ)腎活血膠囊活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Compound-target network of BuShenHuoXue capsule

2.2 補(bǔ)腎活血膠囊“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”構(gòu)建和分析

采用網(wǎng)絡(luò)圖形化工具Cytoscape將上述活性成分及預(yù)測靶點(diǎn)繪制出潛在活性成分和作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)并加以分析，查找網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，以確定補(bǔ)腎活血膠囊中發(fā)揮重要作用的成分和靶點(diǎn)。結(jié)果如圖2所示，通過cytoscape網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建共獲得201個(gè)節(jié)點(diǎn)和982個(gè)關(guān)系。分析可知，木犀草素、槲皮素、谷甾醇和山奈酚等有效成分與網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，而PPARG、ESR1、AR等靶點(diǎn)也能作用于多個(gè)有效成分。“活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”分析顯示，補(bǔ)腎活血膠囊的有效成分之間存在協(xié)同，而協(xié)同調(diào)控的靶點(diǎn)同時(shí)在OP的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不同程度的作用。

2.3 OP相關(guān)基因分析和檢索

2.3.1OP相關(guān)差異表達(dá)基因分析：二次挖掘分析GEO芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片共獲取124個(gè)明顯影響和改變的基因，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)探究和分析這些明顯改變的基因與補(bǔ)腎活血膠囊的作用靶點(diǎn)和OP及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)關(guān)系。差異表達(dá)基因熱圖見圖3。

圖3 差異表達(dá)基因熱圖Fig.3 Different expression genes of osteoporosis

2.3.2數(shù)據(jù)庫檢索已有OP相關(guān)靶點(diǎn)：本研究檢索了5個(gè)國際公認(rèn)的疾病基因相關(guān)數(shù)據(jù)庫，搜集前期研究和報(bào)道的與OP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的已知的相關(guān)靶點(diǎn)基因，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、PharmGKB 分別檢索到44、0、57、295、10個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)，共檢索到356個(gè)已知的OP發(fā)病過程中相關(guān)的靶點(diǎn)。

2.4 補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.4.1補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的蛋白相互作用：網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建機(jī)體的內(nèi)在調(diào)控往往是復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而不是單一的信號通路支配；不同的信號通路和靶點(diǎn)之間會(huì)存在一定程度的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，故藥物的治療作用不僅表現(xiàn)為成分靶點(diǎn)的直接結(jié)合，還表現(xiàn)為直接調(diào)控靶點(diǎn)與間接調(diào)控其他靶點(diǎn)相結(jié)合的調(diào)控方式。通過蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)的挖掘?yàn)閷ふ野悬c(diǎn)的直接、間接調(diào)控作用關(guān)系提供了可能。本研究通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，挖掘出補(bǔ)腎活血膠囊與之產(chǎn)生直接或間接作用的靶點(diǎn)共6444個(gè)，而靶點(diǎn)相互之間的相互聯(lián)系多達(dá)146287種。與此同時(shí)，繪制與OP相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，也挖掘出6129個(gè)直接或者間接相關(guān)的靶點(diǎn)。本研究進(jìn)一步深入分析補(bǔ)腎活血膠囊影響OP發(fā)生發(fā)展中的靶點(diǎn)，繪制蛋白質(zhì)相互作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為網(wǎng)絡(luò)分析和機(jī)制的探討提供了可能。

2.4.2補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的關(guān)鍵：本研究為進(jìn)一步尋找網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，獲得更多節(jié)點(diǎn)的傳遞信息和更高的節(jié)點(diǎn)信息傳遞效率，對補(bǔ)腎活血膠囊調(diào)控OP的蛋白質(zhì)相互作用交集網(wǎng)絡(luò)和網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋵傩苑治鲞M(jìn)行篩選。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯狙芯抗舶l(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)229個(gè)。篩選策略示意圖見圖4。

圖4 補(bǔ)腎活血膠囊關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的目標(biāo)篩選策略圖Fig.4 Target screening strategy for key nodes in BuShenHuoXue capsule

2.5 補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的機(jī)制分析

本研究利用ClueGO分析上述229個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，挖掘其參與的主要信號通路，研究補(bǔ)腎活血膠囊治療OP可能的作用機(jī)制。分析結(jié)果顯示，補(bǔ)腎活血膠囊除與直接作用于OP關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)涉及的信號通路，如Wnt信號通路、TGF-β信號通路和Notch信號通路等有關(guān)，還對P13 K-AKT信號通路、VEGF信號通路和甲狀腺素信號通路等同時(shí)進(jìn)行調(diào)控。見圖5。

圖5 補(bǔ)腎活血膠囊治療骨質(zhì)疏松癥信號通路分析圖Fig.5 Results of signal pathway analysis of BuShenHuoXue capsule in treatment of Osteoporosis

3 討論

隨著全球人口數(shù)量的快速增長和人口老齡化的不斷加減，OP患者人數(shù)增長率也隨之提供，但目前在防治OP方面仍沒有一種行之有效的治療手段。骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑和骨礦化物等西藥在抗OP進(jìn)展方面發(fā)揮了重要的作用，但長時(shí)間應(yīng)用尤其是雙膦酸鹽的安全性問題越來越受到重視[14]，而抗OP新藥的研發(fā)工作仍在進(jìn)行[15]。隨著中醫(yī)藥的不斷繼承與創(chuàng)新，中藥在防治OP方面優(yōu)勢正不斷被挖掘與研究。

中醫(yī)古籍文獻(xiàn)中并沒有“骨質(zhì)疏松癥”這一病名，但根據(jù)其臨床證候歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”“骨極”范疇，認(rèn)為其與腎、脾、瘀關(guān)系密切，基本病機(jī)為腎虧為主，脾虛為輔，血瘀則為促進(jìn)因素[16]。腎主骨生髓、為先天之本，骨的生長、發(fā)育及衰弱均與腎精盛衰關(guān)系緊密，故治療重在補(bǔ)腎。跟蹤文獻(xiàn)，補(bǔ)腎類中藥單體及復(fù)方的抗骨質(zhì)疏松作用已被證實(shí)[17-18]。補(bǔ)腎活血膠囊是山東省知名專家在整體觀念和辨證論治為特色的中醫(yī)基礎(chǔ)理論指導(dǎo)下結(jié)合分期治療歸納總結(jié)而成的臨床經(jīng)驗(yàn)方，在補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨等方面展現(xiàn)出良好的臨床療效。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的技術(shù)對補(bǔ)腎活血膠囊的入血活性有效成分進(jìn)行篩選，對其可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，對其蛋白質(zhì)相互功能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行構(gòu)建與分析，闡明了補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的直接和間接調(diào)控靶點(diǎn)和可能的作用機(jī)制。

從富集結(jié)果分析可知，補(bǔ)腎活血膠囊抗骨質(zhì)疏松的分子機(jī)制主要與直接和間接調(diào)節(jié)骨代謝兩類信號通路相關(guān)。(1)直接影響骨代謝。OP發(fā)生發(fā)展過程中重要的發(fā)病機(jī)制是骨吸收和骨形成過程中的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)發(fā)生異常，故直接影響骨代謝的相關(guān)信號通路是調(diào)控OP發(fā)生發(fā)展過程中主要的信號通路，主要富集在MAPK信號通路、Wnt信號通路、TGF-β信號通路、Notch信號通路、雌激素受體信號通路和破骨細(xì)胞分化通路等。MAPK信號通路對細(xì)胞的增殖、分化進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物作用，在維持骨代謝平衡方面具有重要作用[19]。TGF-β信號通路能通過調(diào)節(jié)由間葉細(xì)胞衍生而來的前體細(xì)胞來促進(jìn)其分別向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞的活性[20-21]。Notch信號通路在成骨細(xì)胞分化過程的早期階段表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中骨保護(hù)素的表達(dá)抑制成骨細(xì)胞向成熟成骨細(xì)胞表型和成骨細(xì)胞功能發(fā)展而抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收[22]。(2)間接影響骨代謝。在顯著富集的信號通路中仍存在部分調(diào)控其他系統(tǒng)的信號通路，如P13 K-AKT信號通路、甲狀腺素信號通路、心肌收縮信號通路和VEGF信號通路等。體內(nèi)代謝之間是相互作用、相互聯(lián)系的，通過全身其他系統(tǒng)，如循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種代謝可以間接影響或干預(yù)骨微環(huán)境。

通過上述通路富集結(jié)果顯示，網(wǎng)絡(luò)集群信號通路中也包括EB病毒感染、DNA復(fù)制、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、前列腺癌、酒精中毒、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白加工等。說明補(bǔ)腎活血膠囊不僅能直接作用于骨代謝相關(guān)信號通路，而且還可以通過影響體內(nèi)多種代謝途徑的靶點(diǎn)發(fā)揮抗OP作用。故補(bǔ)腎活血膠囊抗OP的主要機(jī)制是促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖或抑制破骨細(xì)胞的活性以及對活性成分進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)；同時(shí)，結(jié)果還提示相關(guān)通路之間在一定程度上存在多種多樣的相互聯(lián)系，在治療OP不僅要針對局部關(guān)鍵通路，而且需要針對疾病可能的病因，機(jī)體所處的環(huán)境采用多靶點(diǎn)、多方向、多系統(tǒng)的干預(yù)。上述結(jié)果與中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)恰恰相吻合，治病求本、標(biāo)本兼治，同時(shí)也為中醫(yī)藥治療疾病多靶點(diǎn)、多方面的可行性和優(yōu)勢提供了有利證據(jù)。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析藥物與疾病靶點(diǎn)的相互網(wǎng)絡(luò)關(guān)系能有效地闡明補(bǔ)腎活血膠囊治療OP的疾病機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步的探討分子機(jī)制和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)等提供了重要的理論基礎(chǔ)，使實(shí)驗(yàn)研究更加合理化和可行化。另外，本研究也為藥物與疾病的相關(guān)機(jī)制的研究提供了新的思路和方法，尤其是診斷中藥復(fù)方與某種特定疾病的分子機(jī)制分析。