杜紀紅,吳丹丹,葉正文,蘇明申,周慧娟,李雄偉,張夏南

（上海市農業(yè)科學院林木果樹研究所,上海201403）

蟠桃（Prunus persica Batsch.var.compressa）是桃的一個變種,具有獨特的扁平果形,素有“仙果”“壽桃”之美稱,因其風味香甜、汁液豐富、可食率較高,深受廣大消費者的青睞。但是蟠桃的種質資源十分有限,南方地區(qū)主栽的蟠桃品種為‘玉露蟠桃’,成熟期在8月上旬。由于品種單一,成熟期集中,造成果品滯銷,嚴重影響了蟠桃產業(yè)的發(fā)展,因此市場上需要一些早熟及特早熟蟠桃品種調節(jié)市場余缺。

極早熟、早熟蟠桃品種易出現胚發(fā)育不全等問題,采用胚挽救技術可以克服蟠桃雜交育種過程中經常出現的胚敗育問題,提高胚的萌發(fā)率、成苗率。有研究表明,果實的形態(tài)發(fā)育與種胚敗育有著十分密切的關系。對葡萄敗育的研究發(fā)現,在果實第二次生長高峰開始時,種胚開始出現敗育[1],果實的發(fā)育階段可以作為直觀的觀測標準,來判斷胚的發(fā)育狀態(tài)和敗育時期。因此,研究蟠桃果實和種胚發(fā)育規(guī)律可以為胚挽救取樣時間提供理論依據。

本研究以早熟蟠桃品種‘滬蟠1號’為試材,以當地主栽品種‘玉露蟠桃’（晚熟品種）為對照,開展蟠桃果實和種胚形態(tài)學及生理學的研究,探討蟠桃果實和種胚的發(fā)育規(guī)律,旨在完善早熟蟠桃胚挽救技術體系,提高蟠桃的育種效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘滬蟠1號’和‘玉露蟠桃’?！疁?號’是上海市農業(yè)科學院選育的早熟蟠桃品種,成熟期為7月10號左右?！衤扼刺摇巧虾５貐^(qū)主栽的蟠桃品種,成熟期在7月20號左右。兩個品種花期基本一致,盛花期均為3月22—25日。盛花期后14 d開始取樣直到果實成熟,每2周取一次樣。每個品種選取9棵樹,3棵樹為1個重復,3次重復。試驗年份為2016年。

1.2 測定方法

單果重的測定:用電子天平測定每個果實的單果重,每次調查10個果實,3次重復。

果實縱橫側徑的測定:采用游標卡尺測定,縱徑為果柄至果頂的距離,橫徑為有縫合線的兩個果面之間的距離,側徑為無縫合線的兩個果面之間的距離[2],每次調查10個果實,3次重復。

種子鮮重、干重和干物質比例的測定:使用電子天平稱量種子鮮重,然后將種子置于80—100℃烘箱烘干至恒重,稱量種子干重,干物質比=種子干重∕種子鮮重×100%,每次調查10個種子,3次重復。

種子、胚長度和胚發(fā)育指數（RF值）的測定:使用游標卡尺測量種子和胚的長度（因為蟠桃的胚是近圓型,所以以種子或胚的直徑作為種子或胚的長度）,計算種胚發(fā)育指數。RF值=胚長度∕種子長度。

種子敗育比例的調查:正常發(fā)育的種胚表現為飽滿、圓潤、乳白色、無褐化現象;種胚皺縮干癟,種皮嚴重褐化、變黑,組織軟化,或者胚完全消失,即為種胚出現敗育。敗育率 =敗育種子數∕種子總數×100%。

種子外觀形態(tài)的觀察:隨機取10個蟠桃,用剪刀破核取出種子,進行解剖拍照。

1.3 數據分析

數據采用Excel 2013軟件進行處理分析,采用一般線性模型多因素LSD法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蟠桃果實單果重和大小的發(fā)育規(guī)律

由圖1A可以看出,‘滬蟠1號’的單果重變化曲線與‘玉露蟠桃’相似,可分為3個時期。第一個時期是4月14日—5月12日,果實生長速度快;第二個時期‘滬蟠1號’為5月12日—6月5日,‘玉露蟠桃’為5月12日—6月22日,果實生長速度趨于平緩;第三個時期‘滬蟠1號’為6月5日—7月6日,‘玉露蟠桃’為6月22日—7月21日,基本上是果實成熟前一個月開始進入快速生長期,這個階段果實單果重呈現快速上升趨勢?！疁?號’的單果重增長趨勢與‘玉露蟠桃’基本一致,只是第二個時期持續(xù)時間較‘玉露蟠桃’少2周。雖然生長期不同,果實成熟時,‘滬蟠1號’與‘玉露蟠桃’果實的單果重無顯著差異。

‘滬蟠1號’果實縱橫側徑變化均可分為3個階段,呈現“快-慢-快”的生長趨勢（圖1B、C、D）。第一個階段是4月14日—5月12日,果實生長速度很快,縱橫側徑呈快速增長的趨勢;第二個階段是從5月12日—6月5日,縱橫側徑增長速度呈平緩趨勢;第三個階段是從6月5日—7月21日,果實單果重呈現快速增長趨勢?！衤扼刺摇麑嵖v橫側徑的變化曲線與‘滬蟠1號’基本一致,但緩慢增長期比‘滬蟠1號’長。果實成熟時‘滬蟠1號’的縱橫側徑與‘玉露蟠桃’差異不大。

2.2 蟠桃種子和胚的發(fā)育規(guī)律

圖1 果實發(fā)育期間果實單果重（A）和縱橫側徑（B、C、D）的變化Fig.1 Changes of fruit weight,longitudinal,transverse and lateral diameters during fruit development

圖2 果實發(fā)育過程中種子鮮重（A）、干重（B）和干物質比例（C）的變化Fig.2 Changes of seed fresh weight（A）,dry weight（B）and dry matter proportion（C）during fruit development

‘滬蟠1號’種子的鮮重在4月27日—5月12日呈現快速增長趨勢,5月12日—25日緩慢上升,此后直到果實成熟呈緩慢下降趨勢,‘玉露蟠桃’的種子鮮重一直高于‘滬蟠1號’（圖2A）。后期種子鮮重下降的原因可能是因為種子早期胚乳水分含量高,隨著種子的發(fā)育含水量逐漸降低,再加上敗育胚的比例增高,造成了種子鮮重下降。由圖2B可以看出,4月27日—5月12日兩個蟠桃品種種子的干重均快速上升,‘滬蟠1號’種子干重5月12日—7月6日基本沒有變化;‘玉露蟠桃’種子干重5月12日—6月22日基本沒有變化,6月22日—7月22日迅速上升,這和單果重的迅速生長期相一致?！疁?號’和‘玉露蟠桃’的種子干物質比4月27日—6月5日基本保持不變（圖2C）,從6月5日開始上升,到成熟期達到最大值,兩個品種的種子干物質比變化曲線基本一致,成熟時‘玉露蟠桃’的種子干物質比顯著高于‘滬蟠1號’。

‘滬蟠1號’和‘玉露蟠桃’的種子長度呈先升后降的變化趨勢（圖3A）,這是因為種子內早期為含水量高的漿狀物質,后期胚乳被吸收,子葉開始飽滿,兩個品種種子長度差異較小。如圖3B所示,5月25日之前,兩個品種的胚長度基本相同,5月25日之后,兩個品種的胚長度迅速上升,6月5日,‘滬蟠1號’胚度長為4.4 mm,‘玉露蟠桃’胚長度為6.5 mm,此后‘玉露蟠桃’胚長度緩慢上升,果實成熟時達到最大值7.5 mm,‘滬蟠1號’胚長度先升后降,果實成熟時為5.0 mm,可能因為后期敗育的胚比例增加,造成平均胚長度降低?！疁?號’胚的發(fā)育指數RF值5月12日為0,5月25日—6月22日快速增長,6月22日—7月6日增長緩慢,果實成熟時為0.62;‘玉露蟠桃’胚的RF值5月25日—6月5日快速增長,且增長速率遠高于‘滬蟠1號’,6月5日—7月21日增長趨勢趨緩,果實成熟時為0.89（圖3C）。

圖3 果實發(fā)育過程中種子長度（A）、胚長度（B）、胚發(fā)育指數（C）的變化Fig.3 Changes of seed length（A）,embryo length（B）and PF value（C）during fruit development

2.3 蟠桃種子與胚的外觀形態(tài)觀察

5月12日,‘滬蟠1號’和‘玉露蟠桃’的種子內均為透明膠狀物質（圖4A,E）,但是‘滬蟠1號’有少量種子出現變褐的現象（圖4A）。5月25日,胚乳已經形成,并且可見芝麻大小的白色幼胚,‘玉露蟠桃’的胚乳比較整齊（圖4F）,并且大部分都含有白色幼胚,‘滬蟠1號’的胚乳大小不一（圖4B）,胚乳內有胚的比例較‘玉露蟠桃’低。6月7日,白色的幼胚開始長大,‘滬蟠1號’只有少數幼胚發(fā)育成正常的圓形胚,其余發(fā)育成小的不規(guī)則的畸形胚（圖4C）,而‘玉露蟠桃’白色的胚正常生長（圖4G）。6月21日,‘滬蟠1號’正常的胚繼續(xù)膨大（圖4D）,畸形胚也在膨大,畸形胚往往子葉不正常,‘玉露蟠桃’有約70%的幼胚正常發(fā)育,子葉正常（圖4H）。5月25日—6月7日是胚的子葉快速生長時期,5月25日之前兩個品種的種子內部肉眼觀察不到差異,6月7日基本上可以判斷出正常胚和畸形胚,說明胚乳的異?？赡苡绊懪叩恼０l(fā)育。胚挽救工作盡量選擇在胚敗育前進行,‘滬蟠1號’胚的胚挽救工作需要在5月25日之前進行。

圖4 蟠桃果實發(fā)育過程中種子與胚的外觀形態(tài)變化Fig.4 Changes in appearance and morphology of seed and embryo during fruit development

2.4 蟠桃種子敗育率的變化規(guī)律

果實生長發(fā)育過程中,種子敗育率呈先降后升趨勢,早期種子的敗育率是由于授粉受精不良引起的,后期的敗育率是種胚無法正常發(fā)育引起的。4月20日之前,‘滬蟠1號’種子敗育率高于‘玉露蟠桃’（圖5）,說明‘滬蟠1號’授粉受精不良的比例高于‘玉露蟠桃’。4月20日之后,‘滬蟠1號’的種子敗育率呈上升趨勢,果實成熟時達到43%,‘玉露蟠桃’的種子敗育率上升緩慢,果實成熟時敗育率為12%。

圖5 果實發(fā)育過程種子敗育率的變化Fig.5 Changes of seed abortion rate during fruit development

3 討論

胚敗育在芒果[3]、荔枝[4]、棗子[5]、枇杷[6]、柿子[7]上均有研究,胚挽救是桃早熟品種[8]和無核葡萄[9]育種中使用的重要方法。研究果實和種胚的發(fā)育規(guī)律對于胚挽救最佳時期的選擇具有重要意義。潘學軍等[1]對葡萄敗育研究發(fā)現,在果實第二次生長高峰開始時種胚開始出現敗育,果實的形態(tài)發(fā)育與種胚敗育有著十分密切的關系。‘奧迪亞’無核葡萄及其雜交組合果實外觀大?。v∕橫徑）達到最大并開始變軟為接種的最佳時期,說明其胚挽救的最佳時期為花后42—49 d[10];棗子花后時間和果實大小也可間接反映胚的狀態(tài)[11]。本試驗中‘滬蟠1號’種胚在5月25日之前沒有發(fā)現幼胚,5月25—6月7日產生大量畸形幼胚,此時果實進入硬核期,因此對于‘滬蟠1號’進行胚挽救需要在5月25日之前進行,即硬核期開始之前。

沈德緒等[12]研究不同成熟期的4個桃品種果實和種胚的發(fā)育指出,果實發(fā)育可分為3個時期:快速增長期、緩慢增長期（硬核期）、快速增長期（膨大期）。各品種前后期接近,但在第二期經歷日數顯著不同,早熟品種短,晚熟品種長。本研究中‘滬蟠1號’的硬核期為5月12日—6月5日,大約持續(xù)4周時間,‘玉露蟠桃’的硬核期為5月12日—6月22日,大約持續(xù)6周時間,第二次速長期兩個品種都出現在成熟前4周。兩個品種果實和種胚的發(fā)育規(guī)律與前人結論基本一致[13-14]。

早熟品種的種胚發(fā)育充實時期短,干物質含量低,晚熟種則相反。在果實發(fā)育的第二期（硬核期）和第三期（膨大期）,果實內養(yǎng)分的分配是有差異的,在第二期,營養(yǎng)主要用了滿足核層硬化和胚的生長,保證繁殖用的種子先獲得營養(yǎng),因此該階段果肉部分生長較緩慢。早熟品種的這個過程尚未結束,果實的發(fā)育卻已進入了第三期,其胚沒有更多的營養(yǎng)保證,這也是早熟品種的胚不能發(fā)育良好充實的原因之一。晚熟品種的胚不僅在果實發(fā)育的第二期內充分長大,而且在果實發(fā)育第三期內繼續(xù)充實,胚內干物質含量明顯增高,一般晚熟品種含糖量比早熟品種高。果實發(fā)育后期,胚的營養(yǎng)條件優(yōu)越,也保證了干物質含量的增加,為種子具有較高的發(fā)芽率提供物質基礎[12]。本試驗中,‘玉露蟠桃’的胚在硬核期迅速長大,在果實膨大期干物質快速積累,而‘滬蟠1號’的干物質在果實膨大期積累較慢,這可能主要是因為‘滬蟠1號’果實發(fā)育周期較短。

胚齡（胚的發(fā)育指數）常常使用RF值（胚長∕種子長）來表示,胚齡是胚培養(yǎng)成功的關鍵因素之一。Hesse等[15]對不同胚齡桃幼胚培養(yǎng)研究表明,胚齡大小直接影響胚培養(yǎng)成苗率的高低和胚培苗的生長勢。將胚的發(fā)育狀態(tài)用胚的發(fā)育指數來評價,認為胚的發(fā)育指數接近0.7,是桃胚培成功的最低值。本研究中‘玉露蟠桃’的RF值成熟時達到0.89,‘滬蟠1號’為0.62,說明‘玉露蟠桃’的胚更容易萌發(fā),而‘滬蟠1號’的胚萌發(fā)較難。

植物胚胎中途敗育的原因己有較多報道,大部分研究認為,胚和胚乳是雙受精的產物,二者有極其敏感的發(fā)育平衡關系,胚的發(fā)育依賴胚乳提供營養(yǎng),胚乳提前解體,使幼胚發(fā)育中途停止或解體[8-10,16-18]。本試驗中,5月25日,蟠桃種子內可以區(qū)分幼胚和胚乳,‘滬蟠1號’的胚乳大小不一,幼胚的大小也不均勻,而‘玉露蟠桃’的胚乳大小均勻整齊。胚乳的異常可能是胚后期敗育的一個原因,今后需要在胚乳細胞學方面進行深入研究。