彭 凌,楊旭夫

（韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院∕中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所-韶關(guān)學(xué)院動物疫病診斷中心聯(lián)合實驗室,韶關(guān)512005）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer,RA）可引起鴨、火雞和其他鳥類的接觸性傳染病,即鴨疫里默氏桿菌病[1-2],又稱為鴨傳染性漿膜炎,曾稱為鴨敗血癥、新鴨病、鴨疫綜合癥和鴨疫巴氏桿菌病等。雛鴨易感染,環(huán)境條件惡劣可以增加發(fā)病率,常呈急性或慢性敗血癥,主要病理變化是纖維素性心包炎、氣囊炎、腦膜炎、肝周炎、干酪樣輸卵管炎等,發(fā)病率為5%—90%,病死率高達(dá)80%,常引起小鴨的大批發(fā)病、生長遲緩和死亡[3]。隨著規(guī)?；曫B(yǎng),養(yǎng)殖密度增加,過去散發(fā)的傳染病變?yōu)榇竺娣e群發(fā)[4]。鴨疫里默氏桿菌病成為目前危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一[5],免疫接種是控制該病的一種有效的措施。由于鴨疫里默氏桿菌的血清型越來越趨向多樣化,迄今為止,國際上報道RA血清型就有21種[6-7],絕大部分血清型間缺乏交叉保護(hù),而免疫預(yù)防應(yīng)有血清型針對性才能奏效,這就需要開展RA血清學(xué)調(diào)查。實際上并非每個實驗室都擁有RA的全部血清型,當(dāng)血清型不齊備時,傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法就無能為力;并且,在血清型鑒定過程中,有很多原因會造成分型上的混淆,如不同的試驗方法以及菌株之間的血清學(xué)相關(guān)性等[8]。有研究表明,同一血清型的不同分離株,其在生化特性、致病性或抗原性等方面均存在著差異[9],因此,為準(zhǔn)確掌握 RA的流行病學(xué)情況,本研究采用腸桿菌基因間重復(fù)一致序列RCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC-RCR）對廣東地區(qū)16個鴨場分離到的48株RA進(jìn)行基因分型,尋找該地區(qū)的優(yōu)勢菌株,深入了解RA的流行病學(xué)分布,并通過對分離菌株的ERIC-RCR指紋圖譜的聚類分析,探討分離菌株間的親緣關(guān)系及進(jìn)化關(guān)系,為更好地防治該病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

為本實驗室2011—2013年從廣東地區(qū)16個發(fā)病鴨場中疑似患鴨疫里默氏桿菌病的3—4周齡鴨的腦組織中分離所得,經(jīng)過培養(yǎng)特性與生化特性鑒定為RA,共48株分離株。

1.2 供試試劑

TaKaRa Taq enzyme購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 RA基因組DNA的提取

參考參考文獻(xiàn)[10],采用傳統(tǒng)的酚氯仿法抽提細(xì)菌基因組DNA。

1.4 PCR鑒定

按文獻(xiàn)[11]報道的序列,設(shè)計上游引物（5’-TTACCGACTGATTGCCTTCTAG-3’）和下游引物（5’-AGAGGAAGACCGAGGACATC-3’）,由上海生工生物工程有限公司合成。目的片段大小為546 bp。反應(yīng)體系（總體積為 25 μL）含:10 mmol∕L Tris-HCl（pH 8.3）,10 mmol∕L KCl,2.5 mmol∕L MgCl2,0.4 mmol∕L dNTR,上下游引物各0.5 μmol∕L,基因組DNA 100 ng,Taq酶1.5 U。擴(kuò)增程序為:94℃ 預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);最終72℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

1.5 ERIC-PCR

按文獻(xiàn)[12]報道的序列,設(shè)計引物ERIC-1R（5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’）和ERIC-2R（5’-AA GTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’）,由上海生工生物工程有限公司合成。經(jīng)篩選優(yōu)化,反應(yīng)體系（總體積為 25 μL）含:10 mmol∕L Tris-HCl（pH 8.3）,10 mmol∕L KCl,2.5 mmol∕L MgCl2,0.4 mmol∕L dNTR,引物各1.0 μmol∕L,基因組DNA 100 ng,Taq酶1.5 U。擴(kuò)增程序確定為:94℃ 預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸6 min,35個循環(huán);最終72℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

1.6 指紋圖譜統(tǒng)計分析

以所有分析菌株為變量,不同的擴(kuò)增條帶為樣本,統(tǒng)計擴(kuò)增結(jié)果。根據(jù)所有供試菌株ERIC-RCR電泳圖譜上的不同條帶獲得相似性矩陣,依據(jù)相似系數(shù)計算出遺傳距離,經(jīng)SRSS 10.0軟件根據(jù)歐氏遺傳距離矩陣,采用最短距離法進(jìn)行聚類分析,繪出48株RA菌株間親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR鑒定

48株RA分離株的RCR鑒定結(jié)果如圖1所示,可以看出,本研究中的48株RA分離菌株均能擴(kuò)增出546 bp的目的條帶。

2.2 ERIC-PCR指紋圖譜

采用ERIC-RCR方法對48個RA分離株進(jìn)行分析,得到了清晰的電泳圖譜,且重復(fù)性較好。結(jié)果表明:RCR產(chǎn)物大小在500—3000 bp,DNA多態(tài)性良好,各分離菌株均擴(kuò)增出4—10個條帶,最大接近3000 bp,最小稍大于500 bp（圖2）。根據(jù)每個菌株擴(kuò)增產(chǎn)物中DNA條帶的差異,48株菌株可直觀分為16種指紋圖譜即16個基因型（表1）。1型有1株:H1large;2型有2株:H4、H1;3型有1株:DD4;4型有5株:H5、HC3、HY7、H6、HY4;5型有1株:HC4;6型有1株:tnLarge1;7型有1株:ZL2;8型有8株:ws1、DD2、cn4、dn1、ZL1、Large1、JS6、JS8;9 型有2 株:HR2、ws2;10 型有1 株:HY5;11 型有7 株:cn3、HR1、HR3、HR5、JS1、HN4、dn2;12 型有4 株:1、5、7、9;13 型有6 株:01、02、05、06、09、012;14 型有1 株:ZL9;15 型有2株:14、12;16 型有5 株:Large5、ZL12、SK5、Large2、SK6。

圖1 48株RA分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of 48 RA isolates by PCR

圖2 48株RA分離株ERIC指紋圖譜Fig.2 ERIC-PCR fingerprints of 48 RA isolates

表1 48株RA分離株的基因型Tab.1 The genotypes of 48 RA isolates

2.3 聚類分析

48株RA分離株的ERIC-RCR聚類分析結(jié)果如圖3所示,其分型結(jié)果與視覺分型結(jié)果相同。從1、2、3、5、6鴨場分離基因型1、12—16聚為一大類,說明這些鴨場分離的菌株親緣關(guān)系近,可能有著相同的起源;而從1、3、4、7—16鴨場分離的基因型2—11聚為另一大類,說明這些菌株有著另外的起源。

圖3 48株RA分離株ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析Fig.3 Cluster analysis based on ERIC-PCR fingerprints of 48 RA isolates

3 結(jié)論與討論

本研究為確定廣東地區(qū)的RA病流行情況,首先從廣東各地16個發(fā)病鴨群分離鑒定得到48株RA,進(jìn)一步對48個菌株進(jìn)行了RCR鑒定,擴(kuò)增到了特異性條帶,從分子生物學(xué)水平上驗證了RA常規(guī)鑒定的準(zhǔn)確性。

采用ERIC-RCR對48個分離株進(jìn)行基因分型,區(qū)分這些不同來源的野外分離株。研究結(jié)果表明:各鴨場RA流行情況復(fù)雜,同一鴨場流行多種基因型并且不同鴨場流行基因型不一致。16個鴨場除4個只有1個基因型外,其他12個鴨場流行的基因型均在2個以上,個別鴨場流行的基因型達(dá)4種。流行最多的基因型為8型,共有8株,7個鴨場存在基因型8型,也就是說占被調(diào)查鴨場數(shù)43.75%。其次為11基因型有7株,6個鴨場有該型,占調(diào)查鴨場數(shù)37.5%。雖然13基因型有6株,但只分布在1個鴨場;12基因型有4株也僅分布在1個養(yǎng)鴨場,該場還存在15基因型?；蛐?型有5株分布在3個鴨場,占調(diào)查鴨場數(shù)量的18.75%。16型5株,分布在3個養(yǎng)鴨場。從分離菌株的數(shù)量看,基因型8型和11型最多,但兩個基因型菌株僅覆蓋被調(diào)查鴨場數(shù)的56.25%,二者僅交叉覆蓋3個鴨場。還有基因型1、3、5、6、7、10和14型各為1株,分布在不同的養(yǎng)鴨場。說明該地區(qū)RA病流行情況復(fù)雜,流行菌株呈多元化。

本研究對48株RA分離株的ERIC-RCR聚類分析表明,從本地區(qū)分離到的菌株被聚為兩大類。除鴨場1和3同時流行兩類菌株外,其余14個鴨場只流行一類菌株。根據(jù)聚類分析結(jié)果,可以從兩個聚類中各選1—2個強(qiáng)毒株作為候選疫苗株,制備多價疫苗,以期獲得良好的免疫效果。

RA的血清學(xué)分型廣泛用于RA的流行病學(xué)調(diào)查,但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,血清學(xué)分型方法也出現(xiàn)了一定的局限性。李文陽等[9]認(rèn)為具有相同血清型的不同分離株,在生化特性、致病性或抗原性等方面可能存在一定的差異。Rimler等[13]對從不同國家分離的RA菌株的基因組DNA指紋圖譜研究表明,來源不同的RA,其基因型可能有著明顯的差異;即使自同一地區(qū)分離的相同血清型RA菌株,其DNA指紋圖譜也可能會有所不同。Kiss等[14]進(jìn)一步證實了這點,并認(rèn)為利用DNA指紋圖譜技術(shù)對RA進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查可以彌補(bǔ)血清分型的缺點,減少RA在群之間傳播,從而降低該病原引起的損失。這些研究均表明,RA的血清學(xué)分型方法已不完全適合于RA的流行病學(xué)調(diào)查,以及對RA病的特異性防治研究。而開展RA的基因分型研究更有利于 RA病的特異性防治。本研究利用 ERIC引物,以 RA的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,得到了重復(fù)性好且清晰的電泳圖譜,不同菌株之間可見明顯差異。ERIC-RCR作為一種實用的分子生物學(xué)方法,可在流行病學(xué)調(diào)查中對RA分離株進(jìn)行基因分型。