上官若男，孫景權(quán)，蘇全生

(1.成都大學(xué) 體育學(xué)院，四川 成都 610106；2.北京體育大學(xué) 運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院，北京 100084；3.四川大學(xué) 體育學(xué)院，四川 成都 610065；4.成都體育學(xué)院，四川 成都 610041)

心肌局部的腎素—血管緊張素系統(tǒng)(Renin-angiotensin System，RAS)的生理功能之一是引起心肌肥厚和間質(zhì)纖維化[1]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病高血糖狀態(tài)下，心肌局部交感神經(jīng)活性增加，RAS被激活，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)是RAS的關(guān)鍵酶，ACE活性增加，引起血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)合成增加，AngⅡ作用于心臟局部的I型血管緊張素Ⅱ受體(AT1)，刺激成纖維細(xì)胞分泌一種重要的致纖維化因子—轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)[2]。心肌局部AngⅡ含量增加是上調(diào)TGF-β1表達(dá)的主要原因[3]。大量研究證實，TGF-β1是組織纖維化病變中最重要的促發(fā)因子[4]。結(jié)締組織生長因子(CTGF)可介導(dǎo)多種組織、器官纖維化，心肌組織中CTGF主要由成纖維母細(xì)胞、心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌，具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和基質(zhì)形成的作用[5]。研究表明，TGF-β1可以上調(diào)大鼠心肌CTGF的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)締組織細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，最終引起心肌出現(xiàn)纖維化[6]。心肌膠原纖維以I型膠原纖維(COLI)和III型膠原纖維(COLIII)為主，COLI作為心肌膠原纖維主要成分，是糖尿病心肌纖維化的標(biāo)志纖維。因此，高血糖狀態(tài)下RAS被激活后，ACE活性增加，誘發(fā)AngII合成，激活其下游信號物質(zhì)TGF-β1分泌增加，使CTGF表達(dá)增加，最終導(dǎo)致心肌纖維化，即標(biāo)志纖維COLI增多。

運(yùn)動療法對治療II型糖尿病的長期益處目前已經(jīng)得到公認(rèn)。已有研究表明，運(yùn)動可以改善糖尿病患者的糖脂代謝、增加胰島素敏感性、抑制細(xì)胞凋亡發(fā)展[7]等。另外，近年研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動能降低間歇性低氧誘發(fā)的心肌纖維化程度[8]。國內(nèi)學(xué)者侯改霞等研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動鍛煉改善II型糖尿病大鼠心肌纖維化的可能通路是AGEs/氧化應(yīng)激/NF-κB P65[9]。對于運(yùn)動是否可以通過調(diào)節(jié)心肌組織RAS的功能從而延緩糖尿病心肌病的發(fā)展，目前還鮮見報道。本研究旨在觀察有氧運(yùn)動對II型糖尿病大鼠心肌組織AngⅡ、TGF-β1、CTGF等的影響，探討8周游泳運(yùn)動保護(hù)糖尿病大鼠心臟的機(jī)制是否與RAS有關(guān)，為運(yùn)動鍛煉改善糖尿病誘發(fā)心肌纖維化提供理論支持。

1 研究對象與方法

1.1 II型糖尿病大鼠模型建立及動物分組

SPF級雄性8周齡Wistar大鼠45只，體重200～230 g，由四川大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK(川)2013-026]。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。隨機(jī)抽取32只作為實驗組(DM組和DME組)，以高糖高脂飼料(10%豬油，20%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鈉，66.5%普通飼料)喂養(yǎng)7周以誘導(dǎo)胰島素抵抗，其余13只大鼠作為正常組(C組和CE組)以常規(guī)飼料喂養(yǎng)。高糖高脂飲食7周后，空腹12 h，按30 mg/kg(將STZ溶于0.1 mol/L，pH為4.2的枸櫞酸緩沖液中)體重的劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司)，72 h后尾靜脈采血，監(jiān)測非禁食血糖>16.7 mmol·L-1者為造模成功，正常大鼠注射等體積的枸櫞酸緩沖液。去除高糖高脂喂養(yǎng)過程中死亡5只和未達(dá)到血糖標(biāo)準(zhǔn)的7只大鼠，共有20只大鼠建模成功。將正常大鼠和造模成功大鼠隨機(jī)分為4組，空白對照組(C組，n=7)、單純運(yùn)動組(CE組，n=6)、糖尿病對照組(DM組，n=10)、糖尿病運(yùn)動組(DME組，n=10)。

7周高糖高脂膳食期間所有動物每天稱重，造模成功后所有大鼠每周稱重一次，每天觀察大鼠一般情況。

1.2 運(yùn)動方案

CE組和DME組大鼠采用改進(jìn)的Ploug訓(xùn)練方案，無負(fù)重游泳。將DM和DME組大鼠STZ注射72 h后及C和CE組大鼠枸櫞酸緩沖液注射72 h后的時間定義為基線時間，成模后先進(jìn)行2次適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，每次10 min。訓(xùn)練程序為每周訓(xùn)練6 d，第1周前3 d訓(xùn)練時間分別為20 min、30 min和45 min，第4 d起每天持續(xù)游泳60 min，共訓(xùn)練8周。

1.3 動物取材

最后一次運(yùn)動結(jié)束后，禁食但不禁水12 h，稱重，腹腔注射10%水合氯醛溶液(按3.5 mL/kg注射)麻醉大鼠，腹主動脈抽血，同時摘取心臟，取左心室心肌組織200 mg，勻漿，離心，取上清。

1.4 指標(biāo)測試

心肌組織AngⅡ、TGF-β1、CTGF、COLI和COLIII采用雙位點夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定，試劑盒由美國R&D公司生產(chǎn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有測試結(jié)果均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，組間數(shù)據(jù)比較采用SPSS 17.0軟件Univariate法進(jìn)行統(tǒng)計，組內(nèi)差異比較采用Paired-Samples T Test統(tǒng)計，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P<0.05為差異具有顯著性，P<0.01為差異具有非常顯著性。

2 結(jié)果

實驗期間由于糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致死亡、操作疏忽導(dǎo)致大鼠溺亡等原因，C組、CE組、DM組、DME組最終參與統(tǒng)計的有效樣本量分別為6只、5只、7只、6只。

2.1 運(yùn)動干預(yù)對各組大鼠心肌組織AngII、TGF-β1、CTGF、COLI和COLIII水平的影響

表1 運(yùn)動干預(yù)后各組大鼠心肌組織AngII、TGF-β1和CTGF含量變化

注：★表示與C組相比P<0.05，★★表示與C組相比P<0.01；▲表示與CE組相比P<0.05，▲▲表示與CE組相比P<0.01；●表示與DM組相比P<0.05，●●表示與DM組相比P<0.01。表2同此

與C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05圖1 運(yùn)動干預(yù)后各組大鼠心肌組織AngII含量變化

心肌組織AngII含量變化由表1和圖1可知。運(yùn)動干預(yù)8周后，與C組相比，DM組心肌組織AngII含量顯著升高(P<0.05)，表明II型糖尿病大鼠心肌組織中AngII含量顯著升高。與DM組相比，DME組心肌組織AngII含量顯著降低(P<0.05)。表明8周游泳運(yùn)動顯著降低II型糖尿病大鼠心肌組織中AngII含量。

心肌組織TGF-β1水平變化情況由表1和圖2可知。與C組相比，CE組心肌組織TGF-β1水平與C組幾乎保持同一水平，DM組心肌組織TGF-β1水平顯著高于C組(P<0.05)，表明II型糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1含量顯著升高。與DM組相比，DME組心肌組織TGF-β1水平顯著降低(P<0.05)，表明8周游泳運(yùn)動顯著降低II型糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1含量。

與 C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05。圖2 運(yùn)動干預(yù)后各組大鼠心肌組織TGF-β1含量變化

與C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05圖3 運(yùn)動干預(yù)后各組大鼠心肌組織CTGF含量變化

心肌組織CTGF水平變化情況由表1和圖3可知。與C組相比，DM組心肌組織CTGF水平非常顯著性升高(P<0.01)，表明II型糖尿病大鼠心肌組織中CTGF含量顯著升高。DM組和DME組心肌組織CTGF水平與CE組相比，均無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)DME組心肌組織CTGF水平低于DM組，但在統(tǒng)計學(xué)上不具有顯著性差異，表明8周游泳運(yùn)動有降低II型糖尿病大鼠心肌組織中CTGF含量的趨勢。

表2 運(yùn)動干預(yù)后各組大鼠心肌組織COLI和COLIII含量變化

由表2和圖4可知：8周運(yùn)動后，DM組大鼠心肌組織COLI顯著高于C組(P<0.05)，DME組大鼠心肌組織COLI顯著低于DM組(P<0.05)。DM組和DME組大鼠心肌組織COLIII高于C組和CE組但無顯著性差異(P>0.05)，DME組大鼠心肌組織COLIII低于DM組，但無顯著性差異(P>0.05)。

注：與C組比較，*表示P<0.05；與DM組比較，●表示P<0.05圖4 運(yùn)動干預(yù)后各組大鼠心肌組織COLI和COLIII含量變化

2.2 AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)性分析

表3 CTGF、TGF-β1和AngII之間相關(guān)矩陣

注：**在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。表4同此

由表3和圖5A可知TGF-β1與CTGF之間存在顯著正相關(guān)(r=0.577，P<0.01)。由表3和圖5 B可知TGF-β1與AngII之間不存在相關(guān)性(r=0.146，P>0.05)。由表3和圖5C可知CTGF和AngII之間相關(guān)系數(shù)r=0.293，相關(guān)程度較低，同時P值>0.05，因此兩者之間也不存在相關(guān)性。

2.3 COLI與AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)性分析

表4 COLI與AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)矩陣

由表4和圖6 A可知COLI與AngII之間存在顯著正相關(guān)(r=0.695，P<0.01)。由表4和圖6 B可知COLI與TGF-β1之間相關(guān)系數(shù)r=0.422，相關(guān)程度較好，但是P值為0.064，說明COLI與TGF-β1之間存在可能相關(guān)性。由表4和圖6 C可知COLI與CTGF之間不存在相關(guān)性(r=0.222，P>0.05)。

A：TGF-β1與CTFG之間相關(guān)圖。B：TGF-β1與AngII之間相關(guān)圖。C：CTGF和AngII之間相關(guān)圖圖5 TGF-β1、CTGF和AngII之間相關(guān)圖

A：AngII與COLI之間相關(guān)圖。B：TGF-β1與COLI之間相關(guān)圖。C：CTGF與COLI之間相關(guān)圖圖6 AngII、TGF-β1和CTGF與COLI之間相關(guān)圖

3 分析與討論

研究表明：8周有氧運(yùn)動顯著降低糖尿病大鼠心肌組織中AngⅡ、CTGF、COLI和TGF-β1含量；TGF-β1與CTGF之間存在顯著正相關(guān)，TGF-β1、CTGF與AngII之間均不存在相關(guān)性；COLI與AngII之間存在顯著正相關(guān)，COLI與TGF-β1之間存在可能相關(guān)性，COLI與CTGF之間不存在相關(guān)性。因此我們得出：有氧運(yùn)動對糖尿病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用可能與長期有氧運(yùn)動降低心肌組織中AngⅡ、TGF-β1和CTGF的含量有關(guān)；有氧運(yùn)動改善糖尿病大鼠心肌膠原纖維化的潛在靶點可能是RAS中纖維化因子AngII。

國內(nèi)外的研究均表明，糖尿病心肌病時，心肌組織AngII的濃度明顯升高[10]。賀慧杰[11]在對不同病程糖尿病大鼠心肌病變致纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)：對照組同期相比，糖尿病1月、3月組大鼠心肌組織AngII和TGF-β1含量均顯著升高，提示AngII和TGF-β1在糖尿病心肌病(Diabetic Cardiomyopathy，DCM)的發(fā)生發(fā)展中是一個重要的生化因子。CTGF作為一種新型的致纖維化因子，具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞外間質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)合成的功能，從而引起心肌細(xì)胞肥大、心肌肥厚和心肌間質(zhì)纖維化，影響心臟舒縮功能。多數(shù)研究證實[12-13]，糖尿病心肌病大鼠心肌組織CTGF表達(dá)顯著增高，且伴隨著心肌組織膠原含量和ECM合成增加，提示CTGF是導(dǎo)致心肌肥大、間質(zhì)纖維化的重要因子。研究發(fā)現(xiàn)：II型糖尿病大鼠心肌組織AngII、TGF-β1和CTGF含量顯著高于正常大鼠組，說明在糖尿病的發(fā)病過程中，心肌局部RAS被激活，AngII作為RAS中強(qiáng)有力的效應(yīng)分子，與AT1受體結(jié)合后發(fā)揮生物效應(yīng)，AngII含量的升高刺激成纖維細(xì)胞分泌TGF-β1增加，結(jié)合我們實驗室前期研究，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心組織出現(xiàn)明顯纖維化等心肌病特征。另外，CTGF作為TGF-β1致纖維化的下游因子，糖尿病狀態(tài)下心肌組織TGF-β1的升高上調(diào)了CTGF的表達(dá)[14]。因此，我們也認(rèn)為AngII、TGF-β1和CTGF是糖尿病心肌病發(fā)病過程中重要的致病因子。

長期規(guī)律的適宜運(yùn)動可以引起心臟生理性肥大，提高心肌收縮力，是心臟對運(yùn)動的良好適應(yīng)。但是病理性心肌肥大則表現(xiàn)為心肌收縮力下降和心功能降低。無論是生理性還是病理性心臟肥大，心肌組織AngII均參與心肌間質(zhì)膠原重構(gòu)。田振軍[15]研究證實在中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動導(dǎo)致心肌肥大和心臟功能增強(qiáng)的同時，AngII表現(xiàn)為升高。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動后正常大鼠心肌組織AngII含量升高，推測可能是長期規(guī)律的適宜運(yùn)動引起心肌生理性肥大，提高心肌收縮能力，AngII含量升高是機(jī)體對運(yùn)動的良好適應(yīng)。另外，對于高血壓誘發(fā)病理性心肌肥大來說，長期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動可以顯著降低高血壓大鼠血漿和心肌組織AngII含量、改善心功能指標(biāo)，提示運(yùn)動可以有效改善AngII介導(dǎo)的心肌肥大[16]。同時研究發(fā)現(xiàn)適宜有氧運(yùn)動可以降低肥胖大鼠心肌組織ACE mRNA、AT1受體和CTGF的表達(dá)，從而使心肌纖維化早期良性逆轉(zhuǎn)。由這些研究我們認(rèn)為有氧運(yùn)動可能是通過降低心肌纖維化因子AngII和CTGF等指標(biāo)從而改善病理性心肌肥大。我們研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動干預(yù)8周后，糖尿病運(yùn)動組大鼠心肌組織AngII 、TGF-β1和 CTGF含量顯著低于糖尿病大鼠，說明長期規(guī)律的適宜運(yùn)動通過下調(diào)糖尿病大鼠AngII、TGF-β1和CTGF的表達(dá)，從而有效抑制了心肌局部RAS的活性。

通過AngII、TGF-β1和CTGF之間相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)：TGF-β1與CTGF之間存在顯著正相關(guān)，AngII與TGF-β1之間以及AngII和CTGF之間均不存在相關(guān)性。TGF-β1在心肌組織的高表達(dá)可以上調(diào)其下游因子CTGF的表達(dá)，但是兩者之間是否存在相關(guān)關(guān)系未見報道。另外研究也發(fā)現(xiàn)純化的心肌細(xì)胞有CTGF的基礎(chǔ)表達(dá)，給予TGF-β1刺激可以明顯上調(diào)其表達(dá)[17]。然而矛盾的是本研究并未發(fā)現(xiàn)AngII與TGF-β1和CTGF之間存在相關(guān)關(guān)系，其原因可能是TGF-β和AngII之間存在多個相互作用機(jī)制，作為纖維化發(fā)生的啟動者，AngII能夠通過直接方式和間接方式同時增加TGF-β1轉(zhuǎn)錄和合成[18]；也有可能由本研究樣本量較少引起。 另外，有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病心肌纖維化病程中，心肌組織AngII可以通過刺激TGF-β1的表達(dá)間接增加心肌組織CTGF的表達(dá)，也可直接刺激CTGF的表達(dá)，表明CTGF可以不依賴TGF-β1的活性而獨立介導(dǎo)心肌纖維化和心肌功能障礙。AngII的致纖維化作用不僅是通過TGF-β1，還通過它的其他下游信號調(diào)節(jié)物(如炎癥因子、PAI-1和ILK)來發(fā)揮作用[19]。

大量研究證實當(dāng)糖尿病心臟出現(xiàn)明顯肥厚時，心肌間質(zhì)內(nèi)已出現(xiàn)大量膠原纖維增多現(xiàn)象。心肌膠原纖維以I型膠原纖維(COLI)和III型膠原纖維(COLIII)為主，其中I型占心肌總膠原纖維的80%以上，III型占11%[20]。COLI作為心肌膠原纖維主要成分，其是糖尿病心肌纖維化的標(biāo)志纖維。本研究發(fā)現(xiàn)心肌局部RAS中與COLI呈顯著正相關(guān)的因子為AngII，次之為TGF-β1，COLI與CTGF無相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)心肌局部AngII含量與心肌組織TGF-β1表達(dá)與大鼠心肌舒張功能呈負(fù)相關(guān)，認(rèn)為AngII和TGF-β1的增加可促使心肌膠原含量增加，ECM重構(gòu)而致心臟功能障礙[21]。周敏等[22]研究發(fā)現(xiàn)電鏡觀察發(fā)現(xiàn)心肌TGF-β1和AngII與心肌超微結(jié)構(gòu)的改變呈一致性，認(rèn)為心肌局部TGF-β1和AngII的增加參與了心肌肥厚及間質(zhì)纖維化的形成。AngII作為RAS的主要效應(yīng)物，是心肌細(xì)胞纖維化發(fā)生的主要啟動子，而TGF-β1是AngII發(fā)揮促纖維化作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物。因此，這就解釋了AngII和TGF-β1與心肌纖維化標(biāo)志膠原纖維COLI顯著相關(guān)的原因。然而，本研究中發(fā)現(xiàn)COLI與CTGF無相關(guān)性。2008年Brooks BA等研究發(fā)現(xiàn)血漿中CTGF含量與早期II型糖尿病心臟功能障礙無關(guān)系[23]，其原因可能是在病程4、8、12周，糖尿病大鼠心肌組織CTGF表達(dá)呈持續(xù)增高趨勢，心肌組織TGF-β1在病程第12周時呈下降趨勢，心肌中TGF-β1首先誘導(dǎo)纖維化，CTGF則維持纖維化的發(fā)展。由本文前部分研究可知，TGF-β1與CTGF含量之間存在正相關(guān)，鑒于TGF-β1與COLI相關(guān)，推測COLI與CTGF應(yīng)該相關(guān)。然而，AngII除了通過TGF-β1/CTGF通路發(fā)揮致纖維化作用，還可以通過ROS/HIF1發(fā)揮作用[24]，這就解釋了CTGF與COLI無相關(guān)性的可能機(jī)制。

4 結(jié)論

1)有氧運(yùn)動對糖尿病大鼠心肌損傷的保護(hù)作用可能與長期有氧運(yùn)動降低心肌組織中AngⅡ、TGF-β1和CTGF的含量有關(guān)。

2)有氧運(yùn)動改善糖尿病大鼠心肌膠原纖維化的潛在靶點可能是RAS中纖維化因子AngII。