張永超 張 利 張?jiān)扑?姜媛媛 吳一超

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川 雅安 625014)

亞麻籽是亞麻科(Linaceae)亞麻屬(LinumL.)一年生草本植物亞麻(LinumusitatissimumL.)的成熟種子，其成分主要包括油脂、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、亞麻籽膠、維生素、木酚素等[1-2]。木酚素是一類由雙分子苯丙素合成的天然酚類化合物，具有C6—C4—C6的基本骨架(圖1)，廣泛分布在多種植物中，其中亞麻籽中含量最高[3-4]。作為植物雌激素及良好的天然抗氧化劑，木酚素具有多方面的藥理活性,包括抗腫瘤[5]、預(yù)防心血管疾病[6]、預(yù)防骨質(zhì)疏松和糖尿病[7-8]等。傳統(tǒng)亞麻籽的應(yīng)用僅局限于榨油，榨油后的副產(chǎn)物亞麻籽餅粕除少量用于動(dòng)物飼料外，一般作為肥料或者廢物處理，造成了資源的極大浪費(fèi)[9-10]。因此，以亞麻籽餅粕為原料建立快速分離制備木酚素的方法對(duì)提高資源的有效利用率具有重要意義。

傳統(tǒng)分離純化亞麻木酚素的方法多采用C18填充柱色譜、制備型C18色譜柱和硅膠層析柱色譜。上述方法雖樣品處理量大，但操作較為繁瑣、分離效率較低[11]。Andreas等[12]采用高速逆流色譜對(duì)亞麻木酚素提取物進(jìn)行純化，產(chǎn)品純度達(dá)到90%以上，該方法雖消除了不可逆吸附，但在選擇兩相溶劑系統(tǒng)時(shí)由于缺乏理論指導(dǎo)而較為困難，且往往需要在分離之前采用吸附樹脂進(jìn)行初步分離(富集)。張文斌等[13]采用X-5型大孔吸附樹脂分離純化亞麻木酚素，產(chǎn)品純度達(dá)到了65.7%。大孔吸附樹脂雖然具有吸附性能好、效率高、解吸方便等優(yōu)點(diǎn)，但是多適用于樣品的粗分離，如需含量更高的產(chǎn)品應(yīng)結(jié)合其它分離方法[14]。大孔吸附樹脂或硅膠柱層析與半制備高效液相色譜法(HPLC)聯(lián)用具有分離速度快、產(chǎn)品純度和回收率高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物有效成分的分離制備中[15]，然而目前未見文獻(xiàn)報(bào)道采用大孔吸附樹脂與半制備高效液相色譜聯(lián)用純化亞麻木酚素。

機(jī)體受到輻射或免疫力低下時(shí)，體內(nèi)的自由基會(huì)大量產(chǎn)生，如短時(shí)間難以消除將會(huì)氧化體內(nèi)大分子進(jìn)而損傷組織或器官，如：自由基引起脂質(zhì)過氧化、誘導(dǎo)DNA損傷等[16-18]。DNA的持續(xù)損傷，可能會(huì)引起DNA復(fù)制或翻譯錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致點(diǎn)突變或染色體重排及經(jīng)由各種信號(hào)途徑引起應(yīng)激反應(yīng)，引起細(xì)胞衰老，引發(fā)老年病[19]。木酚素作為植物雌激素及良好的天然抗氧化劑，具有一定消除過氧化的能力[5-8]。因此，本研究擬采用大孔吸附樹脂與半制備高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)純化亞麻木酚素，并探究其對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用，旨在為亞麻籽餅粕的高效開發(fā)利用提供一種新思路。

圖1 木酚素母體結(jié)構(gòu)及亞麻籽中主要的木酚素

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞麻籽粕：菏澤中禾健元生物科技有限公司；

亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司；

乙腈、磷酸：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

NaOH、HCl、甲醇、乙醇、乙酸乙酯：分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；

pH 5.5～9.0精密試紙：上海三愛思試劑有限公司；

D101型大孔吸附樹脂：天津波鴻樹脂科技有限公司；

質(zhì)粒DNA：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；

瓊脂糖、6×DNA Loading Buffer、λ DNA/Hind III Marker：寶生物工程(大連)有限公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：LC-20A型，包括SPD-20A紫外—可見光檢測器、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、2LC-10ADvp泵，日本島津公司；

半制備液相色譜系統(tǒng)：D-P6100型，配有2臺(tái)NP7000輸液泵、NU3000C紫外檢測器，江蘇漢邦科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE52CS-1型，上海亞榮生化儀器廠；

真空冷凍干燥機(jī)：LGJ-12型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

恒溫水浴鍋：B-260型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外可見分光光度計(jì)：A390型，上海翱藝儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-D(III)型，鞏義市英峪高科儀器廠；

高速冷凍離心機(jī)：HC-3018R型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)：Bio-Rad型，美國伯樂公司；

電子分析天平：BSA124S型，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；

玻璃層析柱：2.5 cm×40 cm，上海華美實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 亞麻木酚素HPLC檢測方法的建立 精密稱取適量亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制成0.144 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液全波長掃描，確定HPLC分析波長。選用Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，進(jìn)樣量10 μL，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。考察等度洗脫(0～30 min，20% A∶80% B)和梯度洗脫(0～10 min，15%～20% A；10～15 min，20%～80% A)2種方式對(duì)亞麻木酚素的分離效果，從而建立亞麻木酚素HPLC檢測方法。

1.2.2 亞麻籽粕中木酚素的提取 稱取亞麻籽粕50 g，按1∶10 (g/mL)的料液比加入70%甲醇溶液浸泡3 h，回流提取1 h，過濾，濾渣二次提取，合并濾液。濾液加入4 mol/L的NaOH溶液至最終堿濃度為0.1 mol/L，堿解30 min，加入10% HCl調(diào)pH至5.0～5.5，靜置30 min，離心(4 500 r/min，10 min)，濃縮濾液至原體積的1/20。濃縮液用乙酸乙酯萃取3次，得亞麻木酚素萃取液，備用。

1.2.3 大孔吸附樹脂與半制備HPLC聯(lián)用純化亞麻木酚素

亞麻木酚素萃取液經(jīng)D101型大孔吸附樹脂洗脫(樹脂的預(yù)處理參考文獻(xiàn)[20～21])。先用蒸餾水以1 mL/min 的速率除去多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后在相同條件下依次采用10%，20%，30%，40%的乙醇進(jìn)行洗脫，每個(gè)梯度1.5個(gè)柱體積。收集洗脫液，進(jìn)行檢測后合并目標(biāo)組分洗脫液，濃縮、冷凍干燥得到亞麻木酚素純化物I，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱取淡黃色的亞麻木酚素純化物I適量，70%甲醇溶液溶解稀釋至42 mg/mL。以Megres C18(30 mm×250 mm，10 μm)為色譜柱，乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動(dòng)相，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，通過改變流動(dòng)相的組成(15%～25% A∶85%～75% B)、流速(35，40，45 mL/min)、上樣量(采用體積超載的方式，固定樣品溶液的濃度為42 mg/mL，依次進(jìn)樣1，2，3 mL)確定半制備HPLC分離亞麻木酚素的最優(yōu)條件。在該條件下收集主色譜峰洗脫液，冷凍干燥，得到亞麻木酚素純化物II。

1.2.4 亞麻木酚素純化物II對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用 采用瓊脂糖凝膠電泳法研究亞麻木酚素純化物II對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用，參照張溢等[22]方法并作適當(dāng)修改。

對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用：精密量取2 μL質(zhì)粒DNA，加入4 μL不同濃度的亞麻木酚素水溶液(0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10，0.05，0.00 μg/μL)，混勻，迅速加入10%的H2O22 μL，用滅菌水補(bǔ)足反應(yīng)體系至10 μL。37 ℃水浴20 min后，90 V電壓下瓊脂糖凝膠電泳30 min，結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果。

對(duì)光解條件下H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用(H2O2在光解作用下可以產(chǎn)生羥基自由基)[23]：將上述方法中亞麻木酚素水溶液的濃度變?yōu)?.07，0.09，0.12，0.15 μg/μL，37 ℃水浴20 min變?yōu)樗?0 min后紫外光照射10 min，其它條件不變。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻木酚素HPLC檢測方法的建立

通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液全波長掃描，確定亞麻木酚素在280.5 nm處具有最大吸收波長(圖2)。因此，選擇280 nm作為檢測波長。結(jié)果表明：采用梯度洗脫，0～10 min，15%～20% A；10～15 min，20%～80% A時(shí)，亞麻木酚素可以在15 min內(nèi)獲得良好的分離度。在此條件下，亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖3。

2.2 半制備HPLC分離亞麻木酚素條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的組成 在上樣量1 mL，流速35 mL/min的條件下，考察了流動(dòng)相的組成對(duì)亞麻木酚素分離效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，采用等度洗脫時(shí)分離度較低，且若增大流動(dòng)相中B的比例可以使分離時(shí)間明顯縮短，但與此同時(shí)亞麻木酚素與其附近雜質(zhì)峰之間的分離度也逐漸下降。采用梯度洗脫時(shí)，5 min以后再將乙腈的比例由20%增至25%時(shí)分離度(1.67)及分離時(shí)間(10.136 min)均比較理想。故最優(yōu)洗脫條件為梯度洗脫，0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～15 min，25% A。

圖2 亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖

圖3 亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

圖4 流動(dòng)相的組成對(duì)分離效果的影響

2.2.2 流動(dòng)相的流速 在上樣量1 mL，最優(yōu)洗脫條件時(shí)，考察了流動(dòng)相流速對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖5。圖5(a)、(b)的流速分別為40，45 mL/min。由圖5可知，隨著流速的增加，分離時(shí)間逐漸縮短，但亞麻木酚素與其附近雜質(zhì)峰之間的分離度也逐漸下降。比較圖5(a)、(b)與圖4(d)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為35 mL/min時(shí)，亞麻木酚素的分離度(1.67)及分離時(shí)間(10.136 min)均比較理想，故選擇35 mL/min為最佳流速。

2.2.3 上樣量 在流速35 mL/min，最優(yōu)洗脫條件時(shí)，考察了上樣量對(duì)分離效果的影響，結(jié)果見圖6。圖6(a)、(b)的上樣量分別為84，126 mg。由圖6可知，隨著上樣量的增加，相鄰2組分間的分離度減小，當(dāng)上樣量到達(dá)一定量時(shí)，相鄰組分無法實(shí)現(xiàn)分離。上樣量為126 mg時(shí)，亞麻木酚素與其附近的雜質(zhì)峰分離度較低，考慮產(chǎn)品的純度及分離效率，選擇上樣量為84 mg。

綜上，使用半制備HPLC分離亞麻木酚素的最佳條件為：Megres C18(30 mm×250 mm，10 μm)色譜柱，流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)進(jìn)行梯度洗脫0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～16 min，25% A，檢測波長280 nm，進(jìn)樣量2 mL，流速35 mL/min，柱溫30 ℃。在該條件下，收集色譜圖中標(biāo)1的組分[圖6(a)]，冷凍干燥獲得亞麻木酚素純化物II。

2.3 純度分析

采用已建立的亞麻木酚素含量檢測HPLC方法，繪制亞麻木酚素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=4.369 1×106X-1.187 2×102，R2=0.999 99，線性范圍5.76 ～144.00 μg。亞麻木酚素標(biāo)準(zhǔn)品、萃取液、純化物I、純化物II的色譜圖見圖7。圖7中標(biāo)1的色譜峰峰保留時(shí)間一致，均在10.5 min。定量分析結(jié)果表明：亞麻木酚素萃取液、純化物I、純化物II的純度依次為18%，60%，98%。

大孔吸附樹脂是一類新型高分子材料，具有吸附性能好、效率高、解吸方便等優(yōu)點(diǎn)，在分離純化中草藥活性成分方面顯示出極大的優(yōu)越性，但是所得的樣品純度往往不高，多適用于粗分離[14]。半制備高效液相色譜分離純化具有速度快、產(chǎn)品純度和回收率高等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于植物有效成分的分離制備中，但是成本較高且分離量有限[15]。若使樣品在進(jìn)行半制備高效液相色譜純化之前先得到粗分離(富集)，則可以取得更好的純化效果。因此，本試驗(yàn)通過大孔吸附樹脂與半制備高效液相色譜聯(lián)用技術(shù)純化亞麻木酚素，產(chǎn)品純度可達(dá)到98%，與楊雪艷(純度59.30%)[20]、楊宏志(純度66.71%)等[21]比較具有較大優(yōu)勢。

2.4 亞麻木酚素純化物II對(duì)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用

亞麻木酚素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用見圖8(a)。質(zhì)粒DNA在自然狀態(tài)下為超螺旋結(jié)構(gòu)[24]，電泳結(jié)果顯示為一條譜帶(泳道10)。在誘導(dǎo)處理過程中部分DNA由超螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)殚_環(huán)結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)出2條譜帶，如圖8(a)泳道8和泳道9顯示。此外，電泳條帶的亮度反映了DNA含量的多少，條帶越亮說明DNA含量越高；反之，含量越低[25-26]。因此，由圖8(a)可知：當(dāng)亞麻木酚素濃度為0.05 μg/μL時(shí)，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷無保護(hù)作用；當(dāng)濃度在0.1～0.4 μg/μL時(shí)，亞麻木酚素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷具有顯著保護(hù)作用(與泳道10對(duì)比)。

圖5 流動(dòng)相的流速對(duì)分離效果的影響

圖6 上樣量對(duì)分離效果的影響

圖7 HPLC色譜圖

泳道1～9. DNA+H2O2+不同濃度亞麻木酚素(0.40，0.35，0.30，0.25，0.20，0.15，0.10，0.05，0.00 μg/μL) 泳道10. DNA 泳道11. λDNA/Hind III Marker

(a) H2O2誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA損傷

泳道1、3、5、7. DNA+H2O2+不同濃度亞麻木酚素(0.07，0.09，0.12，0.15 μg/μL) 泳道2、4、6. DNA+H2O2+UV+不同濃度亞麻木酚素(0.07，0.09，0.12 μg/μL) 泳道8. DNA 泳道9. λDNA/Hind III Marker

(b) H2O2光解反應(yīng)誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA損傷

圖8 不同濃度亞麻木酚素水溶液對(duì)質(zhì)粒DNA損傷保護(hù)作用的電泳圖

Figure 8 Electrophoretic pattern of Plasmid DNA in the presence or absence of SDG

根據(jù)亞麻木酚素對(duì)H2O2誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用的研究結(jié)果，進(jìn)一步探討了亞麻木酚素對(duì)光解條件下H2O2誘導(dǎo)質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用，結(jié)果見圖8(b)。由圖8(b)可知，濃度在0.07 ～0.12 μg/μL時(shí)，亞麻木酚素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷具有保護(hù)作用，但對(duì)光解條件下H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷并無顯著的保護(hù)作用。

通過研究亞麻木酚素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷以及H2O2光解反應(yīng)誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用，可間接說明其是否具有抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，亞麻木酚素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用較H2O2光解反應(yīng)誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的強(qiáng)。一方面是由于DNA在紫外光處理下更易遭到破壞[24]，另一方面可能是設(shè)置的亞麻木酚素濃度太低，未能起到保護(hù)作用或是亞麻木酚素在紫外光照射下發(fā)生了分解[27-28]，導(dǎo)致其喪失了原有的抗氧化能力，但需要試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

3 結(jié)論

本研究以亞麻籽粕為原料，采用回流法提取木酚素，提取液經(jīng)乙酸乙酯萃取、D101型大孔吸附樹脂柱分離后，再通過半制備HPLC純化，獲得了純度為98%的亞麻木酚素。優(yōu)化得到半制備HPLC純化亞麻木酚素的條件為：Megres C18(30 mm×250 mm，10 μm)為色譜柱，乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫0～5 min，15%～20% A；5～10 min，20%～25% A；10～16 min，25% A，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃，流速35 mL/min，進(jìn)樣量2 mL。亞麻木酚素質(zhì)量濃度>0.07 μg/μL時(shí)，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，但在測定濃度范圍內(nèi)(0.07～0.12 μg/μL)亞麻木酚素對(duì)光解條件下H2O2誘導(dǎo)的質(zhì)粒DNA氧化損傷的保護(hù)作用不顯著。本研究為亞麻籽粕中木酚素的分離純化提供了新思路。