蔣正財，陳統(tǒng)

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院腫瘤外科，浙江 溫州 325000

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是我國常見惡性腫瘤之一，2015年我國CRC患病人數(shù)男性新增21.57萬，女性新增16.06萬，死亡人數(shù)男性為11.11萬，女性為8萬[1]。近年來，抗血管治療無論在基礎研究還是臨床應用中都取得了一定的成果，如貝伐單抗是美國食品藥品管理局批準的一線治療CRC的重組人源化單克隆抗體，但靶向腫瘤血管藥物卻存在價格昂貴、容易出現(xiàn)不良反應及耐藥等缺點，而我國傳統(tǒng)醫(yī)藥治療腫瘤具有多靶點的特點，以及價格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢，可彌補此方面的缺陷。本課題組前期實驗結果表明枸杞多糖(LBP)可抑制肝癌模型小鼠血管內皮生長皮子(VEGF)的表達[2]，LBP是否具有抑制CRC腫瘤血管形成的作用，其具體作用機制需要進一步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞 6～8周SPF級SD大鼠2只，雌性，體質量(200±20)g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2016-0041。6～8周SPF級Balb/c小鼠16只，雄性，體質量(20±2)g，由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(粵)2016-0041，實驗動物飼養(yǎng)于室溫20～26℃、相對濕度40%～70%的環(huán)境中，晝夜明暗光照時間(12 h明/12 h暗)。小鼠CRC結直腸癌細胞株(CT26)細胞和人真皮微血管內皮細胞(HDMEC)由溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院實驗室保種。

1.2 藥物、試劑與儀器 LBP(質量分數(shù)為60%，生產批號：K140828)購于中國西安開來生物工程有限公司，CD31抗體購于Abcam公司，免疫組化抗兔二抗購于中國北京中杉金橋生物技術公司；PCR引物由中國英濰捷基公司合成，DAB購于美國CST公司；matrigel購于美國BD公司，SYBR Green Mix和逆轉錄試劑盒購于Takara公司。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化)；白光拍攝顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.3 建立小鼠結直腸癌模型 把小鼠隨機分為對照組和實驗組，每組8只，將對數(shù)期生長的CT26細胞按照每只小鼠2×105個/0.2 mL接種于小鼠左側腋前皮下。4天后可看到腫瘤長出，開始給藥，依據(jù)課題組前期研究基礎[3～4]，LBP給藥濃度為50 mg/kg，腹腔注射，每2天給藥1次；游標卡尺測量腫瘤的長短徑，每2天檢測1次，繪制腫瘤生長曲線，共給藥12天。在給藥結束后，脫臼處死小鼠，腫瘤剝離后稱重，放入體積分數(shù)為10%甲醛溶液固定24 h，常規(guī)脫水石蠟包埋、病理制片。

1.4 免疫組化染色 常規(guī)脫蠟-切片腫瘤組織，PBS洗3次，每次5 min，檸檬酸鈉修復液(pH 6.0)高溫高壓熱修復8 min，自然冷卻后放入3%H2O2甲醇溶液37℃浸泡30min，PBS再洗3次，每次5 min，組織上加10%BSA封閉，加一抗CD31置于4℃過夜。將組織切片從封閉盒中拿出，PBS洗3次，每次5 min，于組織上加上二抗辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗37℃孵育1 h，然后PBS洗3次，每次5 min，DAB顯色10 s，流水沖掉，蘇木素復染30 s流水沖洗，接著常規(guī)脫水，最后于組織上滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片，自然晾干。

1.5 大鼠動脈環(huán)實驗 6～8周齡SD雌性大鼠，用乙醚麻醉后脫臼處死；將大鼠浸泡于75%酒精中2 min，放入原代細胞房操作臺中，打開胸腔，沿脊柱剪下大鼠胸主動脈；將血管置于大的細胞培養(yǎng)皿中，放入無菌PBS洗3遍，除去血液；用精密剪、精密鑷剝離干凈血管周圍結締組織，用精密剪將血管剪成1 mm高圓環(huán)；在細胞傳代房間超凈臺中，提前于4℃預冷槍頭、48孔板，在冰上把matrigel 100 μL加入48孔板中，避免氣泡，輕輕拍打48孔板使其分布均勻，把48孔板放入37℃細胞培養(yǎng)箱中15 min使matrigel凝固；用精密鑷將剪好的血管環(huán)放入凝固的matrigel中，使其位于中央，再加入matrigel 100 μL，避免氣泡，將48孔板放入37℃細胞培養(yǎng)箱中15 min使matrigel凝固。根據(jù)預實驗，LBP藥物濃度為500 μg/mL及1000 μg/mL兩個濃度，用EBM培養(yǎng)基配制，500 μL/孔，每天觀察血管生長情況，8天后，向48孔板中加入4%多聚甲醛固定液，室溫固定30 min后拍照。

1.6 CCK 8細胞增殖實驗 將CT26和HDMEC對數(shù)生長期細胞消化計數(shù)，以2000個/孔接種于96孔板中，第2天棄掉培養(yǎng)基，LBP藥物濃度設計為0、50、100、200、500、1000 μg/mL，用培養(yǎng)基稀釋后，每孔100 μL加入，48 h后，每孔加入10 μL CCK8，細胞培養(yǎng)箱孵育2 h后，酶標儀450 nm測量每孔吸光度。

1.7 QPCR檢測HDMEC細胞腦組織特異性血管生成抑制因子1（B AI1）基因的表達 培養(yǎng)HDMEC細胞，對數(shù)期生長的細胞匯合度達到90%，消化，計數(shù)，按1.0×105個/孔鋪6孔板。第2天，棄掉培養(yǎng)基，用EBM培養(yǎng)基配置500 μg/mL和1000 μg/mL的枸杞多糖用藥組，對照組加入相同體積的EBM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。48 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，棄掉PBS；RNA提取、逆轉錄嚴格按照試劑盒說明書進行，cDNA用DEPC稀釋8倍后，按照試劑盒說明進行操作分析。BAI1引物序列為，上游引物：5'-CAGAGGAGCAGGTGGACAGAGAAAG-3'，下游引物：5'-TCAGGA GACAGTGGAAGCAGCG-3'。

1.8 統(tǒng)計學方法 腫瘤組織血管密度采用Image pro plus軟件對結果進行處理得出數(shù)據(jù)，血管環(huán)周長用ipp軟件計算。所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件進行作圖。計量資料以(±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 LBP對CT 26小鼠結直腸腫瘤生長的影響 見圖1。LBP用藥組CT26 CRC小鼠腫瘤重量為(0.31±0.04)g小于對照組(0.63±0.06)g(P＜0.05)(圖1B)；繪制腫瘤生長體積曲線，發(fā)現(xiàn)LBP可抑制小鼠腫瘤的生長(P＜0.05)(圖1A)。

2.2 LBP對腫瘤組織血管生成的影響 見圖2。LBP用藥組血管數(shù)(31.6±2.45)條/視野明顯少于對照組(42.3±3.28)條/視野(P＜0.05)，表明LBP可抑制腫瘤血管的形成。

圖1 LBP對CT 26小鼠結直腸癌腫瘤生長的影響

圖2 LBP對腫瘤組織血管生成的影響

2.3 LBP對大鼠動脈環(huán)血管形成的影響 見圖3。觀察動脈環(huán)周圍新生成的血管數(shù)量，LBP用藥劑量分別在500 μg/mL和1000 μg/mL時血管數(shù)明顯少于對照組，表明LBP對大鼠動脈環(huán)血管形成具有抑制作用，且與濃度相關。

圖3 LBP對大鼠動脈環(huán)血管形成的影響(×60)

2.4 LBP對CT 26及HDMEC細胞增殖的影響 見圖4。LBP藥物濃度設定在0～1000 μg/mL之間，隨著濃度的增加，LBP對小鼠CRC CT26細胞(圖4A)及HDMEC細胞(圖4B)增殖均無明顯的影響。

圖4 LBP對CT 26及HDMEC細胞增殖的影響

2.5 LBP對HDMEC內皮細胞B AI1表達的影響 見圖5。與對照組比較，LBP 500 μg/mL及1000 μg/mL處理HDMEC后，BAI1 表達上調(P＜0.01)。

圖5 LBP對HDMEC內皮細胞B A I1表達的影響

3 討論

惡性腫瘤侵襲與轉移是治療失敗的主要原因，血管形成為腫瘤細胞提供了豐富的氧及營養(yǎng)物質，為促進其惡性生物學行為創(chuàng)造了條件[5]?？寡苌伤幬锿ㄟ^切斷惡性腫瘤細胞的養(yǎng)分補給，并阻斷侵襲轉移的血行通道，使腫瘤細胞靜止于休眠狀態(tài)，因此，以抑制腫瘤血管形成為目的生物治療受到廣大研究者關注。

研究證實許多中藥具有抗血管作用，例如蜂毒素、去甲斑蝥素、蟾毒靈三種抗腫瘤中藥對人體肝癌細胞HepG2細胞及人臍靜脈內皮細胞ECV304細胞的生長均有不同程度抑制作用，在一定范圍內呈濃度和時間的依賴性，雞胚絨毛尿囊膜實驗證實三種藥物不同濃度均能抑制腫瘤血管形成[6]。潘子民等[7]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可通過下調腫瘤VEGF2 mRNA及蛋白的表達量，阻滯腫瘤血管生成。中醫(yī)藥治療腫瘤具有多靶點的特點，以及價格低廉、毒副作用小的優(yōu)勢，可彌補靶向抗腫瘤血管治療方面的缺陷，從而為腫瘤的治療開辟更好的途徑。

課題組前期實驗結果表明LBP可抑制肝癌模型小鼠VEGF的表達[2]，同時發(fā)現(xiàn)LBP可抑制自發(fā)乳腺癌小鼠腫瘤生長及減少腫瘤間質血管形成[4]。本研究在體內實驗中，采用CT26結直腸癌小鼠腫瘤模型，LBP整體給藥情況下，與對照組比較，LBP對結腸癌小鼠腫瘤的生長亦具有一定的抑制作用，采用免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤間質血管在用藥后明顯減少。進一步通過大鼠動脈環(huán)實驗發(fā)現(xiàn)LBP可抑制血管形成；但體外細胞培養(yǎng)，CCK8細胞增殖實驗卻沒有發(fā)現(xiàn)LBP對小鼠結腸癌細胞CT26及HDMEC增殖的抑制作用，說明LBP對腫瘤生長的抑制作用與直接殺傷腫瘤細胞或者抑制血管內皮細胞的增殖無明顯的關系，有可能是通過一些復雜的體內微環(huán)境因素抑制了內皮細胞的功能和血管的形成。BAI1特異性表達在腦組織內，屬于G蛋白偶聯(lián)受體的B家族，具有抑制血管生成作用[8]。QPCR檢測LBP可促進BAI1表達上調，其抑制血管形成機制是否是通過上調BAI1表達實現(xiàn)的，還需要進一步探明。由于中藥抗腫瘤作用具有多靶點的特征，其體內抑制腫瘤生長及抑制血管形成的具體機制需要深入研究。