林麗慧 陳 瑾 唐 梅

(海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，儋州 571700)

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)是引起繼發(fā)不孕的重要因素，免疫系統(tǒng)功能異常是引起URSA的主要原因之一[1]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是機(jī)體的重要免疫抑制細(xì)胞，能夠通過(guò)分泌免疫抑制因子，抑制機(jī)體異常細(xì)胞免疫反應(yīng)[2]。大量的研究發(fā)現(xiàn)URSA的發(fā)生與患者體內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量減少有緊密關(guān)系，Treg細(xì)胞移植可以有效治療機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自體組織器官的異常攻擊[3-5]。濾泡調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tfr細(xì)胞)是體液免疫的主要抑制細(xì)胞，最新的研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞能促進(jìn)Tfr細(xì)胞的增殖[6]。因此Treg細(xì)胞被認(rèn)為是URSA主動(dòng)免疫治療的重要靶標(biāo)。胎盤(pán)蛋白14(PP14)是一種子宮內(nèi)膜合成的糖蛋白，在維持妊娠中發(fā)揮著重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)PP14具有顯著的免疫抑制作用，協(xié)助胎盤(pán)的免疫豁免[8]。然而PP14對(duì)Treg細(xì)胞的影響及其進(jìn)一步調(diào)控Tfr細(xì)胞目前國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1試劑 PP14購(gòu)于Abcam公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津TBD公司；RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；CD4、CD25、CXCR5、Foxp3、CTLA-4和HLA-G流式抗體購(gòu)于BD公司； IL-10和TGF-β的ELISA試劑盒購(gòu)于欣博盛生物科技公司；IL-10和TGF-β中和抗體購(gòu)于Abcam公司；Treg細(xì)胞分選試劑盒購(gòu)于BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分離和培養(yǎng) 收集健康獻(xiàn)血志愿者的外周血，將其與PBS進(jìn)行1∶1混合，之后緩緩加入到淋巴細(xì)胞分離液的上層，2 000 r/min離心 20 min，用吸管吸取白膜層，PBS清洗3次后，置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2Treg細(xì)胞的檢測(cè) 淋巴細(xì)胞分離后分兩組，對(duì)照組和PP14組(培養(yǎng)基中加入10 μg/ml的PP14[9])，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，之后加入CD4、CD25、CTLA-4和HLA-G的抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后破膜，加入Foxp3抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后流式檢測(cè)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例及其表面CTLA-4和HLA-G的表達(dá)。

1.2.3Treg細(xì)胞分選 我們采用試劑盒中的磁珠分選淋巴細(xì)胞中Treg細(xì)胞。人淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血中的淋巴細(xì)胞，之后置于15 ml離心管中，加入4 ml PBS重懸；通過(guò)間接法標(biāo)記出帶有磁性的非CD4+T細(xì)胞，同時(shí)加入PE-CD25抗體；將離心管置于磁力架上，靜置5 min后，吸取上層的細(xì)胞，置于另一個(gè)離心管中；加入抗PE的磁珠，室溫孵育1 h，之后將離心管置于磁力架上，靜置5 min后，棄上清；PBS反復(fù)清洗3次后將分離出的Treg細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.4ELISA檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分組同前，PP14刺激 48 h后，使用Treg細(xì)胞分選試劑盒分選出Treg細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)上清，2 000 r/min離心10 min，吸取上清液，采用ELISA方法檢測(cè)上清中IL-10和TGF-β的濃度，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 我們采用Transwell小室進(jìn)行Treg細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為幾組：對(duì)照組(單純的淋巴細(xì)胞)、共培養(yǎng)組(上室為對(duì)照組淋巴細(xì)胞中分選的Treg細(xì)胞，下室為淋巴細(xì)胞)和PP14組(上室為PP14組淋巴細(xì)胞中分選的Treg細(xì)胞，下室為淋巴細(xì)胞)，共培養(yǎng)48 h后，收集下室的細(xì)胞，加入CD4和CXCR5的抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后破膜，加入Foxp3抗體，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次后流式檢測(cè)淋巴細(xì)胞中CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細(xì)胞的比例。

2 結(jié)果

2.1PP14促進(jìn)Treg細(xì)胞比例的升高 流式的結(jié)果顯示對(duì)照組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的比例為(0.060 97±0.008 94)%，PP14組Treg細(xì)胞的比例為(0.137 30±0.013 37)%，兩組之間差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.748，P=0.009 0)，這說(shuō)明PP14可以促進(jìn)Treg細(xì)胞比例的增加，增強(qiáng)機(jī)體的免疫抑制能力。見(jiàn)圖1。

2.2PP14對(duì)Treg細(xì)胞表面的免疫抑制分子沒(méi)有顯著作用 流式結(jié)果顯示對(duì)照組CTLA-4和HLA-G的平均熒光強(qiáng)度分別為62.23±4.134和7.550±1.078，PP14組分別為62.47±5.705和8.227±1.097，兩組之間沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=0.108，P=0.918 6；t=0.439，P=0.682 8)，這些結(jié)果說(shuō)明PP14對(duì)Treg細(xì)胞表面的免疫抑制分子沒(méi)有顯著作用。見(jiàn)圖2。

2.3PP14促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌免疫抑制分子 ELISA的結(jié)果顯示對(duì)照組Treg細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-10和TGF-β的濃度分別為(6.663±1.181)ng/ml和(1.400±0.379)ng/ml，PP14組的濃度分別為(31.070±3.380)ng/ml和(6.800±0.608)ng/ml，兩組差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=6.817，P=0.002 4；t=7.537，P=0.001 7)。這些結(jié)果說(shuō)明PP14可以促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌免疫抑制分子，進(jìn)一步促進(jìn)免疫抑制功能的發(fā)揮。見(jiàn)圖3。

圖1 PP14促進(jìn)Treg細(xì)胞比例的升高Fig.1 PP14 increased proportion of Treg cellsNote:n=6,VS control,*.P<0.05.

圖4 PP14增強(qiáng)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞比例增加的作用Fig.4 PP14 enhanced proportion of Tfr cells induced by Treg cellsNote:n=6,VS control,*.P<0.05;VS co culture group,#.P<0.05;VS PP14 group,△.P<0.05.

圖2 PP14對(duì)Treg細(xì)胞表面的免疫抑制分子沒(méi)有顯著的作用(n=6)Fig.2 PP14 had no significant effect on immunosupp-ressive molecules of Treg cells(n=6)

圖3 PP14促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌免疫抑制分子Fig.3 PP14 promoted Treg cells to secrete immunosuppr-essive moleculesNote:n=6,VS control group,*.P<0.05.

2.4PP14增強(qiáng)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞比例的增加 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示對(duì)照組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細(xì)胞比例為(0.044 0±0.007 94)%，共培養(yǎng)組比例為(0.213 3±0.056 08)%，兩組之間差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.990，P=0.040 3)；PP14能夠增強(qiáng)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞比例的增加，相對(duì)于共培養(yǎng)組，PP14組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細(xì)胞比例增加了2.71倍，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.815，P=0.008 6)；IL-10和TGF-β的阻斷均能部分阻斷這種增強(qiáng)作用，相對(duì)于PP14組，IL-10和TGF-β阻斷組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細(xì)胞比例分別下降了69.20%和56.54%，差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.868，P=0.008 2；t=3.670，P=0.021 4)；我們進(jìn)一步同時(shí)加入IL-10和TGF-β的阻斷抗體，共同阻斷組CD4+CXCR5+Foxp3+Tfr細(xì)胞比例為(0.092 33±0.036 01)%，與共培養(yǎng)組相比，沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明PP14增強(qiáng)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞比例增加主要是通過(guò)IL-10和TGF-β介導(dǎo)的。見(jiàn)圖4。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)在育齡期女性的發(fā)生率約為1%～5%,其中40%～60%原因不明,稱(chēng)為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URSA)。免疫功能異常是引起URSA的重要原因，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)于URSA的治療至關(guān)重要[10]。Treg細(xì)胞是維持機(jī)體免疫耐受的重要細(xì)胞，在妊娠期可以有效抑制母體對(duì)胎兒的同種異體免疫排斥反應(yīng)，維持正常的妊娠。大量的研究表明URSA的發(fā)生與孕婦體內(nèi)Treg細(xì)胞比例下降緊密相關(guān)，增加Treg細(xì)胞比例可能是治療URSA的很有發(fā)展前景的方法[3-5]。PP14是一種胎盤(pán)蛋白，具有顯著的免疫抑制作用[11]。我們的研究發(fā)現(xiàn)PP14能夠誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的增殖，促進(jìn)Treg細(xì)胞分泌免疫抑制分子，進(jìn)而可能在調(diào)控URSA異常免疫反應(yīng)中發(fā)揮著顯著的治療作用。B細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫在URSA的發(fā)生和發(fā)展中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。Tfr細(xì)胞是體液免疫的負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞，能夠通過(guò)抑制Tfh細(xì)胞和IL-21的分泌，而抑制B細(xì)胞增殖和分化為漿細(xì)胞[12]。Treg細(xì)胞與Tfr細(xì)胞緊密相關(guān)，Treg能夠通過(guò)細(xì)胞表面抑制性分子或者分泌免疫分子，誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞的增殖[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)PP14能夠顯著增強(qiáng)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞比例的增加，IL-10和TGF-β在其中可能發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。通過(guò)中和性抗體抑制Treg細(xì)胞分泌的IL-10和TGF-β，能夠顯著降低Tfr細(xì)胞的比例。

綜上，我們的研究發(fā)現(xiàn)PP14能夠通過(guò)IL-10和TGF-β通路，顯著增強(qiáng)Treg細(xì)胞誘導(dǎo)Tfr細(xì)胞比例的增加。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步研究在URSA患者體內(nèi)Treg細(xì)胞和Tfr細(xì)胞之間的相關(guān)作用，為URSA的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)。