劉 帥 王獻春 楊 燦 劉國燕 丁 宇 宋向鳳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院輸血科，新鄉(xiāng) 453003)

Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)和(Obesity,OB)是與生活方式緊密相連的內(nèi)分泌代謝性疾病，二者發(fā)病機制復(fù)雜，至今仍未完全闡明，近年來炎癥反應(yīng)病因?qū)W理論受到廣泛關(guān)注，該理論認為，T2DM是一種慢性低度炎癥性疾病，炎癥因子可通過增加胰島素抵抗，促進T2DM的發(fā)生和發(fā)展；OB患者脂肪組織中的T細胞和巨噬細胞含量明顯增加，二者通過影響前脂肪細胞和脂肪細胞的功能引起炎癥因子表達上調(diào)，誘導(dǎo)并參與機體的炎癥反應(yīng)，因此，肥胖也被認為是一種自然免疫和全身低度慢性炎癥性疾病[1]。

高遷移率族蛋白B1(High mobility group box-1,HMGB1)作為近年來發(fā)現(xiàn)的重要新型晚期炎癥介質(zhì)，是高遷移率族蛋白B家族中唯一可釋放到細胞外并具有細胞因子活性的蛋白分子，可介導(dǎo)多種急慢性炎癥性疾病[2]。前期研究顯示，高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪組織和外周血中HMGB1表達水平增高，但關(guān)于HMGB1及TLR4與T2DM及OB的相關(guān)性研究還未見報道，HMGB1及TLR4與T2DM及OB的發(fā)生發(fā)展是否有關(guān)也待進一步研究。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實驗對象 本次實驗選取2017年1月至8月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院患者以及同期在我院健康體檢中心體檢人員共80例作為研究對象，其中男40例，女40例。根據(jù)T2DM診斷標準和口服葡萄糖耐量試驗(Oral glucose tolerance，test，OGTT)結(jié)果判斷標準以及OB的診斷標準，按2×2析因?qū)嶒炘O(shè)計方法將研究對象分為T2DM-OB組、T2DM-NOB組、NGT-OB組、NGT-NOB組，共4組，每一組為20例，男10例，女10例。4組受檢者的性別構(gòu)成及年齡間具有均衡性(P>0.05)。

1.1.2實驗試劑 TrizolReagent購自Gibco公司；SYBG Green PCR Master Mix購自ABI公司；PBS緩沖液由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究中心配制；RBC Lysis Buffer(10×)購自上海嶸崴達實業(yè)有限公司；異丙醇購自天津博迪化工股份有限公司；三氯甲烷購自煙臺市雙雙化工有限公司；無水乙醇購自天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；dNTPs、隨機引物、核糖核酸酶抑制劑(RNase inhibitor)、5 × Reverse transcriptase buffer購自TaKaRa；HMGB1 ELISA檢測試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.2方法

1.2.1ELISA 將各濃度標準品液、空白孔液、待測標本均100 μl加入相對應(yīng)的酶標孔板底部，不要產(chǎn)生氣泡，輕輕混勻，封膜，37℃溫育1 h。甩去孔內(nèi)液體，加100 μl/孔檢測試劑A，封膜，37℃溫育1 h。加350 μl/孔稀釋洗滌液(1×)，靜置1～2 min，甩去孔內(nèi)液體，洗板3次，最后一次在吸水紙上拍干。加100 μl/孔檢測試劑B，封膜，37℃溫育30 min。洗板5次。加90 μl/孔底液，換膜封板，37℃避光溫育10～20 min。加終止液50 μl/孔，混勻后即刻在酶標儀450 nm波長處測量各孔光密度值(OD值)。

1.2.2細胞總RNA提取及qPCR 首先利用紅細胞裂解液(10×RBC Lysis buffer)將紅細胞裂解，用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA2.1 μl、SYBR Select Master Mix 20 μl、引物18.9 μl(由原液稀釋20倍后的工作液)，總體積為41 μl，混勻后每個20 μl分別加樣在1主孔和1副孔，上機進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min擴增40個循環(huán)，以GAPDH作為內(nèi)參，進行結(jié)果分析。Real-time qPCR所用的引物序列見表1。

1.2.3相關(guān)生化指標的測定 空腹血糖(Fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、三酰甘油(Triglyceride，TG)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein，LDL)等生化指標均在日立7600-020全自動生化分析儀上進行檢測，步驟略。

表1Real-timequantitativePCR引物

Tab.1Real-timequantitativePCRprimers

GeneSequenceprimersTLR4F：5′?CGAGGAAGAGAAGACACCAGT?3′R：5′?CATCATCCTCACTGCTTCTGT?3′GAPDHF：5′?AGAAGGCTGGGGCTCATTTG?3′R：5′?AGGGGCCATCCACAGTCTTC?3′

2 結(jié)果

2.1HMGB1濃度在不同組的比較分析 T2DM-OB組濃度高于T2DM-NOB組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；NGT-OB組濃度高于NGT-NOB組(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；T2DM-OB組濃度高于NGT-OB組(P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；T2DM-NOB組濃度高于NGT-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1和表2。

2.2不同組的TLR4表達水平的比較分析 qPCR檢測顯示，T2DM-OB組表達水平高于T2DM-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；NGT-OB組表達水平高于NGT-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義；T2DM-OB組表達水平高于NGT-OB組(P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義； T2DM-NOB組表達水平高于NGT-NOB組(P<0.001)，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2和表3。

圖1 HMGB1濃度Fig.1 Concentration of HMGB1Note:Compared with T2DM-OB，*.P<0.05，#.P<0.001；compared with NGT-NOB，△.P<0.001，▲.P<0.05.

表2HMGB1濃度

Tab.2ConcentrationofHMGB1

Groupsnχ2SDT2DM?NOB1)3)205399 689622 135T2DM?OB205735 954567 540NGT?NOB204021 379237 031NGT?OB2)4)204297 087469 092

Note：Compared with T2DM-OB，1)P<0.05,2)P<0.001；compared with NGT-NOB，3)P<0.001,4)P<0.05.

2.3HMGB1與各指標的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HMGB1和TLR4呈正相關(guān)(r=0.549，P<0.001)，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3；HMGB1和BMI(r=0.386)、TG(r=0.621)、FPG(r=0.543)均呈正相關(guān)(P<0.001)，而和HDL呈負相關(guān)(r=-0.255)，P<0.05， 見圖4～7。以HMGB1為因變量，以性別、年齡、BMI、FPG、TC、TG、HDL和LDL等因素為自變量，擬合多元線性回歸模型，模型的擬合優(yōu)度R2=0.465,擬合優(yōu)度較好，自變量對因變量的解釋程度較高。利用方差分析對HMGB1多元回歸分析模型進行檢測，得出回歸模型P<0.001，說明該模型有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。通過回歸分析的結(jié)果顯示，自變量中只有FPG和TG的回歸系數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，兩指標對HMGB1有預(yù)測作用，見表4。

圖2 TLR4表達水平Fig.2 Expression levels of TLR4 Note:Compared with T2DM-OB，*.P<0.001；compared with NGT-NOB，#.P<0.001.

表3TLR4表達水平

Tab.3ExpressionlevelsofTLR4

Groupsnχ2SDT2DM?NOB1)2)204 31601 28902T2DM?OB209 44953 42648NGT?NOB201 55700 39687NGT?OB1)2)203 80051 11379

Note：Compared with T2DM-OB，1)P<0.001；compared with NGT-NOB，2)P<0.001.

圖3 HMGB1和TLR4的相關(guān)性(r=0.549,P<0.001)Fig.3 Linear correlation analysis between HMGB1 and TLR4(r=0.549,P<0.001)

圖4 HMGB1和BMI的相關(guān)性(r=0.386,P<0.001)Fig.4 Linear correlation analysis between HMGB1 and BMI(r=0.386,P<0.001)

圖5 HMGB1和TG的相關(guān)性(r=0.621,P<0.001)Fig.5 Linear correlation analysis between HMGB1 and TG(r=0.621,P<0.001)

圖6 HMGB1和FPG的相關(guān)性(r=0.543,P<0.001)Fig.6 Linear correlation analysis between HMGB1 and FPG(r=0.543,P<0.001)

圖7 HMGB1和HDL的相關(guān)性(r=-0.255,P<0.001)Fig.7 Linear correlation analysis between HMGB1 and HDL(r=-0.255,P<0.001)

表4HMGB1多元回歸分析

Tab.4MultiplelogisticregressionanalysisofHMGB1

IndexUnstandardizedcoefficientBStd ErrorStandardizedregressioncoefficienttP(Constant)3987 0271096 480-3 6360 001SEX-241 979166 858-0 139-1 4500 151AGE4 5498 5820 0490 5300 598BMI9 05623 1300 0450 3920 697FPG68 77829 0080 2772 3710 020TC-67 827159 813-0 049-0 4240 673TG345 576106 5620 4733 2430 002HDL-121 659231 198-0 052-0 5260 600LDL-50 511184 363-0 029-0 2740 785TLR455 98032 8550 2221 7040 093

Note：Only the regression cofficients of FPG and TG were statistically significant(P<0.05)，and the two indicators have predictive effect on HMGB1.

3 討論

HMGB1是高遷移率族蛋白家族的重要一員，傳統(tǒng)觀點認為HMGB1是低分子量的非組蛋白染色體蛋白質(zhì)，但近年研究發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)的HMGB1可由免疫細胞在應(yīng)對感染、損傷或其他炎癥刺激時主動或被動地釋放至胞外，作為一種炎性細胞因子發(fā)揮重要作用[3]。HMGB1一旦被釋放到細胞外，通過結(jié)合受體，誘導(dǎo)活化核因子(Nuclear factor，NF)-κB轉(zhuǎn)位，致使炎性細胞因子分泌，從而引發(fā)炎癥免疫反應(yīng)[4]。TLRs作為HMGB1的受體是公認的促進炎癥的先天免疫受體，尤其是TLR4，可以通過機體內(nèi)毒素的激活，進而引起核因子的活化以及炎性細胞因子的釋放[5，6]。

T2DM和OB是嚴重危害人類健康、影響生活質(zhì)量的常見疾病，近年來的研究表明T2DM和OB不僅是代謝性疾病，而且是一種與炎癥有關(guān)的疾病，促炎細胞因子的過度表達與T2DM和OB有著緊密的聯(lián)系[7]。對T2DM和OB患者的研究表明：白細胞計數(shù)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)和炎性細胞因子的表達水平增加引起系統(tǒng)性炎癥和脂質(zhì)的積累，最終導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗等代謝綜合征疾病[8，9]。目前大多數(shù)學(xué)者認為T2DM和OB是一種慢性低度炎癥性疾病，慢性低度炎癥是T2DM和OB的中心環(huán)節(jié)。

本實驗將HMGB1濃度在T2DM-OB組與NGT-OB組、T2DM-NOB組與NGT-NOB組分別進行比較，結(jié)果顯示前者的HMGB1濃度均顯著高于后者(P<0.001)，這一實驗結(jié)果表明糖代謝紊亂可以增加HMGB1的濃度。實驗研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞在高血糖的刺激下釋放HMGB1并結(jié)合、活化TLR4[10]。最近的動物實驗研究表明，Ⅰ型糖尿病小鼠血清HMGB1濃度與對照組相比表達水平顯著升高[11]。將TLR4表達水平在T2DM-OB組與NGT-OB組、T2DM-NOB組與NGT-NOB組分別進行比較，前者的表達水平均顯著高于后者(P<0.001)，進一步將HMGB1濃度與TLR4表達水平進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者呈明顯的正相關(guān)(P<0.001)，說明HMGB1及TLR4對T2DM具有明顯的影響，在患T2DM后HMGB1及TLR4的表達水平會明顯升高；相關(guān)性分析顯示HMGB1濃度與FPG呈正相關(guān)(P<0.001)，通過回歸分析發(fā)現(xiàn)FPG對血漿HMGB1的表達水平有預(yù)測作用，說明HMGB1與機體是否糖耐量異常存在密切的關(guān)系。根據(jù)這次實驗結(jié)果以及相關(guān)實驗證據(jù)得出：HMGB1通過結(jié)合TLR4誘導(dǎo)胰島細胞凋亡及胰島素抵抗并進一步促進T2DM的發(fā)生與發(fā)展。

本實驗我們將HMGB1濃度在T2DM-OB組與T2DM-NOB組、NGT-OB組與NGT-NOB組分別進行比較，結(jié)果顯示前者濃度均大于后者(P<0.05)，證明HMGB1濃度與肥胖癥存在一定的關(guān)系。Guzman-Ruiz等[12]研究表明肥胖患者血漿HMGB1水平增加但脂肪組織中mRNA水平降低，據(jù)此他們得出一個結(jié)論：脂肪組織不是HMGB1誘導(dǎo)炎癥的主要促進者。隨后的實驗研究顯示皮下脂肪組織分泌HMGB1增加，但皮下脂肪組織HMGB1的分泌量與血漿含量沒有相關(guān)性(r=0.10，P=0.58),HMGB1表達水平的這種差異被認為是炎癥觸發(fā)來源于脂肪組織的脂肪間質(zhì)細胞，后者進一步分泌HMGB1，而成熟脂肪細胞對HMGB1的分泌沒有促進作用[13，14]。本實驗通過將TLR4表達水平在T2DM-OB組與T2DM-NOB組、NGT-OB組與NGT-NOB組分別進行比較發(fā)現(xiàn)，前者的表達水平均高于后者(P<0.05)；HMGB1濃度與TLR4表達水平進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)(P<0.001)，說明HMGB1及TLR4對肥胖癥有影響，在患OB后HMGB1及TLR4的表達水平明顯升高，這一實驗結(jié)果表明：HMGB1介導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)極有可能是通過TLR4途徑發(fā)揮作用。有研究指出，HMGB1通過結(jié)合TLR4引起NF-κB核易位從而誘導(dǎo)促炎細胞因子和黏附分子的轉(zhuǎn)錄并最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[15]。本次實驗相關(guān)性分析還發(fā)現(xiàn)HMGB1表達水平與TG、BMI呈正相關(guān)(P<0.001)，進一步回歸分析提示TG對HMGB1有一定的預(yù)測功能，這表明HMGB1表達水平受脂質(zhì)代謝的影響。有實驗研究表明在囊性纖維化糖尿病患者發(fā)病期間HMGB1表達水平的增加與糖尿病患者的BMI有關(guān)[16，17]。

綜上所述，通過對T2DM和OB患者HMGB1及TLR4表達水平的檢測發(fā)現(xiàn)：T2DM及OB患者體內(nèi)HMGB1、TLR4的表達水平明顯增高，HMGB1表達水平與糖脂代謝紊亂存在相關(guān)性，HMGB1與TLR4結(jié)合后通過相應(yīng)的途徑參與T2DM及OB的病理生理發(fā)展過程。