伍麗賢 陳 立 康可人

(廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司,廣州 510663)

3，4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(3，4-methylene dioxymetham-phetamine，MDMA)是一種化學(xué)合成的具有興奮和致幻作用的甲基苯丙胺類化合物，是搖頭丸的主要成分[1]。MDMA是1912年由德國Merck公司研發(fā)的食欲抑制藥物，后來因其具有精神致幻和欣快的作用在20世紀90年代成為世界最流行的濫用藥物之一[2]。MDMA濫用后容易上癮且依賴性強不易脫毒，導(dǎo)致各種暴力犯罪，對社會造成極大的危害[3]。因此及時有效快速的診斷是防止MDMA濫用的有效措施之一。目前對MDMA濫用的常用檢測方法有化學(xué)試劑檢測法、氣相色譜法、高效液相色譜法和免疫檢測法，其中膠體金免疫層析法是現(xiàn)今毒品現(xiàn)場快速檢測最主要的方法[3]，它是利用抗原抗體免疫反應(yīng)結(jié)合膜層析技術(shù)的一種新型現(xiàn)場快速檢驗技術(shù)，具有快速、準確、簡便、成本低廉的特點，是國際公認的現(xiàn)場檢測的首選方法[4,5]。根據(jù)美國食品和藥品管理局的規(guī)定，MDMA快速檢測試劑檢測靈敏度為500 ng/ml，因此篩選出高特異性、合適靈敏度的MDMA單克隆抗體是制備MDMA快速診斷試劑的關(guān)鍵。本文通過特殊修飾的MDMA免疫原，有效篩選到特異靈敏的陽性細胞株，其抗體成功應(yīng)用于膠體金免疫層析試劑中，為制備檢測MDMA的膠體金免疫層析法提供了材料。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑及動物 RPM1640、胎牛血清(FBS)、HAT、HT、青鏈霉素溶液和聚乙二醇(PEG，Mv4000)均購自美國Gibco 公司；弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)購自美國Sigma 公司；小鼠骨髓瘤細胞系(SP2/0)為本實驗室傳代保存；羊抗鼠IgG-HRP 二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；MDMA 檢測試劑盒(膠體金法)購自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司；小鼠單抗Ig 類/亞類鑒定用酶標二抗套裝由洛陽佰奧通實驗材料中心提供；硝酸纖維素膜為美國Millipore 公司產(chǎn)品；氯金酸購自天津化工廠；檸檬酸三鈉購自廣州試劑廠； MDMA-OVA和MDMA-KLH 偶聯(lián)蛋白由本室制備保存；6～8周齡SPF級雌性BALB/c純系小鼠由中山大學(xué)實驗動物中心提供；實驗室用水為超純水，所用化學(xué)試劑均為分析純級別。

1.1.2儀器 BB15 型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan MK3酶標儀和NanoDrop 2000C 分光光度計均為美國Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為重慶奧特光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ECFG21 高效細胞電融合儀為日本NEPA GENE 產(chǎn)品；Milli-Q AdvantageA10 超純水儀為美國Millipore 公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機為日本HITACH 產(chǎn)品；接觸式噴膜機為美國Imagene Technology Inc 公司產(chǎn)品。

1.1.3標準品及尿液樣本 MDMA 陽性標準品由廣州正孚檢測技術(shù)有限公司劉曉云博士惠贈。參照美國國家藥物濫用研究所(NIDA)標準制備250、500、750 ng/ml的高中低3個靈敏度濃度。

陰性標準品取自健康人陰性尿樣，加入濃度0.5% 疊氮鈉防腐劑。編號為No.1、No.2、No.3，由本實驗室配制。300例臨床樣本來自廣州白云戒毒所、廣東省第二人民醫(yī)院。30種常見濫用藥物及常用藥物進行特異性檢測系列由本實驗室配制保存。

1.2方法

1.2.1動物免疫及細胞融合 首次免疫時用MDMA-KLH免疫原與等體積的FCA充分乳化后以100 μg/只的劑量于小鼠背部及腹股溝分多點皮下注射免疫BALB/c純系小鼠，以后每14 d用MDMA-KLH免疫原與等體積的FIA乳化后加強免疫小鼠，用間接競爭ELISA方法[6]檢測第3次免疫后7 d采集小鼠尾靜脈血的血清效價，間接競爭ELISA方法如下：①包被：MDMA-OVA抗原以1 μg/ml包被酶標板，37℃孵育1 h或4℃放置過夜，洗板1次。②封閉：每孔加入200 μl含3%BSA的PBST 37℃孵育2 h后洗板1次。③加一抗：每孔加入50 μl 4 μg/ml 濃度的MDMA標準品然后加入50 μl的免疫血清37℃孵育反應(yīng)30 min，洗板3次，并同時設(shè)對照孔(只加100 μl免疫血清)，且陰性對照孔加入100 μl 未經(jīng)免疫的小鼠血清。④加二抗：每孔加入100 μl 20 000倍稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 37℃孵育反應(yīng)30 min，洗板3次。⑤顯色：每孔加入100 μl TMB顯色液顯色15 min。⑥終止：每孔加入50 μl 2 mol/L H2SO4，酶標儀450 nm讀取吸光值。根據(jù)公式計算其抑制率[7]：(Y-X)/(Y-Z)×100%。其中X表示加入MDMA標準品及免疫血清的OD值，Y表示不加標準品的對照孔OD值，Z表示陰性對照孔OD值。抑制率越高代表血清中抗體對MDMA的敏感性越好，因此選擇效價最高且抑制率最高的小鼠進行腹腔注射，免疫原劑量為100 μg/只。3 d后取其脾細胞與SP2/0按ECFG21電融合儀說明書步驟進行電融合，并將雜交瘤細胞滴加至40個96孔板中，放于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.2.2間接競爭ELISA法篩選陽性細胞株 細胞融合后10 d左右待雜交瘤細胞長滿孔底40%～50%時，以MDMA-OVA(1 μg/ml)包被酶標板，用間接競爭ELISA方法(同1.2.1中間接競爭ELISA方法)檢測各孔細胞上清，篩選效價高且抑制率高的陽性細胞株轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)。采用有限稀釋法[7]對陽性雜交瘤細胞株多次亞克隆直至篩選出陽性的單克隆細胞株，并對該細胞株進行擴大培養(yǎng)和凍存保種。

1.2.3腹水的制備及純化 采用常規(guī)小鼠體內(nèi)誘生法制備腹水[7]，并經(jīng)過正辛酸-飽和硫酸銨法純化得到單克隆抗體[8]。

1.2.4MDMA單抗抗體的鑒定

1.2.4.1效價的測定 采用間接競爭ELISA方法(同1.2.1中間接競爭ELISA方法)檢測腹水及單克隆抗體的效價，包被MDMA-OVA(1 μg/ml)，以從1∶10 000稀釋比開始以10倍梯度稀釋腹水和抗體為一抗，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG為二抗，同時設(shè)陰性(N)、空白和陽性(P)對照，效價以P/N>2.1為陽性標準。

1.2.4.2單抗抗體特性鑒定 抗體亞類鑒定采用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標抗體套裝試劑盒鑒定，按試劑說明書操作。單抗抗體的SDS-PAGE電泳純度鑒定參考文獻[9]進行操作，上樣量為2 μg。

1.2.5MDMA單抗抗體在膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用

1.2.5.1免疫膠體金溶膠的制備 取0.01%氯金酸水溶液100 ml加熱煮沸，攪動下加入1%枸櫞酸三鈉水溶液，金黃的氯金酸水溶液在2 min內(nèi)變?yōu)樽霞t色，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積。取1 ml膠體金溶膠于離心管中，用0.1 mol/L K2CO3調(diào)節(jié)金溶膠pH值至9.0，加入20 μg MDMA單克隆抗體，混勻后室溫放置2～3 min。加入50 μl 1%PEG20000溶液以飽和游離的膠體金。10 000 r/min離心30 min除去上清并用PB洗滌 2～3 次后，用含1% BSA的PBS配制成原體積的1/10放4℃保存[10]。

1.2.5.2膠體金免疫層析試劑的制備 將制備的免疫金溶膠按25 cm2/ml均勻涂布玻璃纖維制備金標墊。將MDMA-BSA偶聯(lián)物(T線)和羊抗鼠二抗(C線)包被在硝酸纖維素膜上制備包被膜，放于25℃濕度<30%的干燥房干燥24 h。將包被膜、金標墊、樣品墊和吸水紙如圖1所示組裝裁切成4 mm寬的試紙條。

1.2.5.3膠體金免疫層析試紙的臨床應(yīng)用 MDMA的膠體金免疫層析試劑是采用免疫競爭抑制法，即尿液中的MDMA小分子與包被在膜上的MDMA-BSA蛋白同時競爭膠體金標記的抗體。當(dāng)尿液中MDMA濃度≥500 ng/ml時，T線不顯色，呈陽性，當(dāng)尿液中MDMA濃度<500 ng/ml時，T線顯色呈陰性。①靈敏度檢測：根據(jù)NIDA標準，MDMA檢測靈敏度為500 ng/ml，用陰性尿液基質(zhì)配制其±50% cut-off值標準品，即用試紙條檢測250 ng/ml和750 ng/ml的標準品。②特異性檢測：30種常見濫用藥物及常用藥物進行特異性檢測用陰性尿液基質(zhì)配制成100 μg/ml，檢測MDMA試劑條與常用藥物交叉情況。

2 結(jié)果

2.1MDMA單克隆抗體的制備和鑒定

2.1.1抗體純度的鑒定 經(jīng)過2次細胞融合，采用間接競爭ELISA法進行篩選，篩選得到4C10、4D10、7D11、8D4 4株分泌抗MDMA單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并對細胞株進行亞克隆后保存。

圖1 膠體金免疫層析試紙條組裝示意圖Fig.1 Schematic diagram of colloidal gold immunochromatograohic strip

其中細胞株8D4能穩(wěn)定分泌抗MDMA的抗體，體內(nèi)誘生法制備單克隆抗體腹水，用正辛酸-飽和硫酸銨法純化，得到抗MDMA單克隆抗體。用SDS-PAGE電泳MDMA單抗分析得出該抗體分別有重鏈和輕鏈兩條帶，純度約為93%(圖2)。

2.1.2抗體效價的測定 采用間接ELISA法測定8D4抗體的效價為1∶1×106左右，檢測結(jié)果如圖3所示。

2.1.3單抗抗體類型及亞類鑒定 使用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶(HRP)標抗體套裝鑒定MDMA 8D4單抗Ig亞類為IgG1型，見圖4。

圖2 抗體的SDS電泳圖Fig.2 SDS-PAGE for purified MabsNote:Lane 1.8D4；Lane 2.Marker.

圖3 抗體效價測定結(jié)果Fig.3 Titer of purified Mabs

圖4 抗體亞類鑒定Fig.4 Identification of antibody subclasses

2.3.1MDMA單抗在膠體金免疫檢測中的應(yīng)用 將制備的免疫金溶膠按25 cm2/ml均勻涂布玻璃纖維制備金標墊，與包被好MDMA抗原的NC膜組裝成檢測試劑條，分別檢測陰性尿液樣本、陽性標準品和30種常用藥物。

2.3.1.1膠體金檢測陰性和陽性尿樣結(jié)果 用組裝好的MDMA膠體金試劑盒檢測編號為No.1、No.2、No.3陰性尿液，以及250、500、750 ng/ml的3個濃度陽性標準品。根據(jù)NIDA標準，要求MDMA免疫層析檢測試劑陽性檢測限為500 ng/ml，因此檢測陰性和陽性250 ng/ml時T線顯色，結(jié)果呈陰性；檢測陽性500 ng/ml和750 ng/ml時T線不顯色，結(jié)果呈陽性。檢測結(jié)果如圖5和圖6。

2.3.1.2藥物交叉反應(yīng)檢測 取30種常見濫用藥物及常用藥物進行特異性檢測，結(jié)果如表1顯示。MDMA檢測試劑盒僅與鹽酸麻黃堿、鹽酸搖頭丸、甲基苯丙胺、鹽酸安非他命、安非他命、鹽酸偽麻黃堿6種苯丙胺類藥物有交叉反應(yīng)；與其他毒品和藥品沒有非特異性反應(yīng)，顯色為陰性結(jié)果。搖頭丸的主要成分是MDMA，故顯色為陽性，其他5種藥物是苯丙胺類藥物及其衍生物，其結(jié)構(gòu)類似，所以有交叉反應(yīng)為正常現(xiàn)象。結(jié)果顯示該抗體特異性良好。

2.3.1.3臨床尿樣的檢測 用組裝好的MDMA試劑盒檢測300份臨床尿樣，其中有280份為非吸毒人員陰性樣本，20份確診為MDMA陽性樣本。檢測結(jié)果如表2顯示MDMA試劑盒能檢測出全部陽性樣本，陽性符合率為100%，MDMA試劑盒能檢測出全部陰性樣本，陰性符合率為100%。

圖5 陰性測試結(jié)果Fig.5 Test results of negative samples

圖6 陽性測試結(jié)果Fig.6 Test results of positive samples

表1常見濫用藥品及常用藥品交叉反應(yīng)檢測結(jié)果

Tab.1Determinationofcross-reactionformostusedandabuseddrugs

DrugsColor?renderingindexDrugsColor?renderingindexDrugsColor?renderingindexEphedrineHydrochloride++Caffeine+++PseudoephedrineHydrochloride++PethidineHydrochloride+++CocaineHydrochloride+++TabellaeParacetamoli+++MethylmorphinePhosphate+++TramadolHydrochloride+++Paracetamol+++Acetylcodeine+++Amitriptyline+++DextromethorphanHydrobromide+++FentanyiCitrate+++Methamphetamine+CefaclorCapsules+++Methadone+++Epobarbital+++Estroven(Sleepingpill)+++Ketamine+++Morphine+++Extenze(Aphrodisiac)+++Oxycodone&Acetaminophen+++O3AcetylMorphine+++Cephalexin+++HydrochloricEcstasypill-AmphetamineHydrochloride++LidocaineHydrochloride+++Oxazepam+++Amphetamine++Levonorgestrel+++

Note：Concentration of these drugs were 10 μg/ml，“+++” was the most deepest color with strongly positive result of T line，“++” was the second deep color with negative result of T line，“+” was the third deep color and it was positive result of T line，“-”was strongly positive result with no color of T line.

表2臨床尿樣檢測結(jié)果

Tab.2Determinationofclinicalurine

TheconfirmedurinesamplesNegativePositiveTotalGoldcolloidalimmunochromatographictestkitofMDMANegative2800280Positive02020Total28020300

3 討論

3.1免疫偶聯(lián)載體蛋白的選擇 選擇正確的蛋白載體是制備小分子抗體的關(guān)鍵。本文采用KLH為載體成功合成了MDMA人工抗原并在膠體金產(chǎn)品上獲得良好的效果。由于血藍蛋白來源于無脊椎動物，與常用于免疫的哺乳動物(例如鼠、兔、羊等)同源性最遠，因此最易產(chǎn)生抗體，但產(chǎn)生的大量抗體主要是針對血藍蛋白本身，而針對偶聯(lián)的半抗原的抗體只占很小一部分；相反，來自哺乳動物的白蛋白因為與用作免疫動物的同源性較高，因而最難產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體多數(shù)針對偶聯(lián)的半抗原。但根據(jù)文獻報道[11,12]，用KLH偶聯(lián)的完全抗原會比用BSA偶聯(lián)的完全抗原免疫小鼠所產(chǎn)生的抗體血清的特異性更強，原因可能為：一是KLH分子量大，表面有更多的半抗原結(jié)合位點，免疫過程中能使抗原的特征基團暴露面更大從而獲得特異性更強的抗體[13]；二是帶BSA載體的完全抗原從乳化到注射免疫過程中會經(jīng)歷一次蛋白結(jié)構(gòu)外翻再于小鼠體內(nèi)復(fù)性的過程，復(fù)性后蛋白表面的半抗原分子可能被包裹到蛋白內(nèi)部，而KLH則不存在這個過程，故其能產(chǎn)生特異性更強的抗體[14,15]。

3.2有效的ELISA檢測系統(tǒng)的建立 建立有效的ELISA篩選機制同樣是人工抗原應(yīng)用到膠體金產(chǎn)品上的重要因素。毒品類膠體金檢測系統(tǒng)具有快速反應(yīng)的特點，它要求抗原抗體在室溫下5 min之內(nèi)完成反應(yīng)，但ELISA檢測系統(tǒng)抗原抗體反應(yīng)通常需要在37℃反應(yīng)半小時以上，因此本文在檢測小鼠免疫血清及在篩選雜交瘤細胞時用間接競爭ELISA方法來篩選以選出效價高且對MDMA小分子敏感性高的抗體。