佀傳亞 潘少坤 凌志洋 伊春艷 鄧志瑞 謝幼華 孫 兵

(上海大學生命科學學院,上海 200444)

乙型肝炎是一種由乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的急、慢性肝部炎癥，全球大約有1/3的人口感染乙肝病毒，中國是感染乙肝病毒人口密度較大的國家[1]。對于乙肝病毒，干擾素和核苷類藥物，如恩替卡韋、富馬酸替諾福韋酯是主要的治療手段[2]。但是傳統(tǒng)的治療方案周期長，且容易因為病毒產生的基因突變而使機體產生抗藥性[3]，所以國內外的研究者也在探究利用免疫的方法治療乙肝[4]。預防方面，利用基因工程重組表達的乙肝疫苗和血源來源的乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B hyper-immune globulin ，HBIG)起著重要的作用。HBIG是一種從人的血清或者血漿中分離出來的針對乙肝病毒表面抗原S蛋白的免疫球蛋白。由于其針對乙肝病毒具有很好的阻斷作用，所以廣泛應用于乙肝病毒暴露后的預防，阻斷母嬰傳播以及對乙肝表面抗原陽性患者肝移植后的乙肝復發(fā)的預防上。據(jù)文獻報道，HBIG能通過阻斷乙肝病毒 S蛋白與肝細胞表面受體結合，進而抑制病毒顆粒感染宿主細胞；或通過抑制S蛋白以及病毒顆粒從細胞內釋放[5]，達到阻斷病毒感染的目的。傳統(tǒng)制備HBIG的方法都是從正常人的血液中篩選出高效價的血漿，經(jīng)低溫乙醇法提純而獲得。這種獲得的方式雖然十分有效，但是具有以下幾個弊端：①獲得好的免疫球蛋白特別依賴于高效價的血漿，質控較復雜。②免疫球蛋白為血液制品，直接來源于人血，具有潛在的血源性疾病傳染的風險[6]。相對于通過血液直接分離的抗體，非血清來源的全人單克隆抗體可能更安全并且展現(xiàn)出更好的效果[7]。本研究利用流式分選和單細胞RT-PCR技術獲得三株全人單克隆抗體[8]。并通過對抗體結合，抗原表位以及中和病毒能力的探究，為正常人暴露于乙肝病毒后的緊急治療、阻斷母嬰傳播，肝臟移植后乙肝表面抗原陽性患者的乙肝復發(fā)提供預防手段，并為預防性乙肝疫苗的設計提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1實驗材料、試劑 生物素化試劑購自Thermo scientific公司；AriaⅡ流式分選儀；FITC Mouse Anti-Human CD19、APC Mouse Anti-Human IgG購自BD Bioscience；Streptavidin PE 購自Biolegend；Super-ScriptTMIII First-Stand Synthesis System for RT-PCR(Cat:18080-051)購自Invitrogen；S(adw，ayw，adr型)蛋白購自Prospec公司；普通DNA離心柱型PCR產物純化試劑盒，離心柱型質粒小提試劑盒，離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京Transgen生物技術有限公司；Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)Antibody，Goat Anti-Human IgG(Fc Specific)-Peroxidase antibody，Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)-Peroxidase antibody購自Sigma；多肽合成自上?？齐纳锟萍加邢薰?；ELISA板采購自Thermo scientific公司；ExpiCHO-STM細胞購自Thermo scientific公司；HepG2-NTCP細胞為本實驗室自己構建； KHB乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒購自上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1抗原蛋白生物素化 根據(jù)說明書配置10 mmol/L 的Biotin Reagent并按照每mol蛋白對應20 mol Biotin計算0.05 mg的S蛋白需要的Biotin Reagent的量?；旌暇鶆虮芄猓糜诒? h。再利用脫鹽柱洗去多余的Biotin Reagent。

1.2.2流式分選特異針對S蛋白的記憶B細胞 單個B細胞的獲得主要利用RT-PCR技術。利用Ficoll從健康獻血者血清中分離出PBMC細胞，并利用FITC標記CD19,APC標記IgG,PE標記1.2.1中生物素化后的S蛋白。用流式細胞儀分選出三陽性的單細胞，并利用96孔板進行收集，每孔一個記憶B細胞。

1.2.3抗體表達載體的構建以及抗體的表達 利用反轉試劑對1.2.2中篩選出的單個特異性的記憶B細胞進行反轉獲得每個細胞的總cDNA，利用人抗體恒定區(qū)序列設計引物通過巢式PCR進行擴增[9]。將PCR產物進行DNA電泳，選擇其中可以同時出現(xiàn)重輕鏈的樣品進行割膠回收進行測序，利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/網(wǎng)站來選擇出測序結果顯示為完整抗體的樣品，根據(jù)抗體基因的族譜信息，分別構建到對應的,帶有人類抗體恒定區(qū)IgG1基因的IgH、Igκ和Igλ載體中。構建成功的重輕鏈表達載體利用ExpiFectamineTM轉染試劑共轉染至ExpiCHO-STM 細胞中進行表達。8 d后收集細胞上清并利用Protein G進行純化。

1.2.4細胞上清濃度測定 利用coating buffer將Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)Antibody包被至ELISA板中，濃度為5 μg/ml,每孔100 μl，4℃過夜，PBST洗3次后利用2%的BSA進行封閉，每孔200 μl，37℃ 2 h。PBST再次洗3次后加入標準品(human IgG)和待測樣品，每孔100 μl。其中標準品梯度稀釋，濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0 ng/ml，待測樣品按照80、400、2 000、10 000倍進行稀釋。37℃孵育2 h后PBST洗板3次，加入Goat Anti-Human IgG(Fc-specific)Antibody 進行孵育(1∶8 000)，每孔100 μl，常溫避光1 h，PBST洗板3次后，利用TMB顯色液顯色，每孔100 μl,利用1 mol HCl作為終止液，每孔50 μl。450 nm吸光度測定吸光值。

1.2.5抗體結合能力測定 購買的S蛋白利用coating buffer 包被至ELISA板中，濃度為5 μg/ml,每孔100 μl，4℃過夜。PBST 3次后利用2%的BSA進行封閉，每孔200 μl ，37℃2 h。PBST再次洗3次后加入待測抗體，濃度為5 μg/ml ，每孔100 μl。37℃孵育2 h后PBST洗板3次，加入Goat Anti-human IgG(Fc-specific)Antibody 進行孵育(1∶8 000)，每孔100 μl，常溫1 h。PBST洗板3次后，利用TMB顯色液顯色，每孔100 μl,利用1 mol HCl作為終止液，每孔50 μl。450 nm吸光度測定吸光值。

1.2.6變性ELISA 將自然狀態(tài)下的S蛋白溶液與終濃度分別為0.1%十二烷基硫酸鈉和50 mmol/L 二硫蘇糖醇混合均勻，100℃5 min，進行蛋白變性。利用coating buffer包被至ELISA板中，同時包被自然狀態(tài)下的S蛋白作為對照,4℃過夜，其他步驟同1.2.5。

1.2.7多肽結合試驗 每條肽段利用coating buffer稀釋包被至ELISA板中，濃度為100 μg/ml,每孔100 μl，4℃過夜，其他步驟同1.2.5。

1.2.8病毒中和試驗 HBeAg的檢測利用KHB乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(YZB/國 0770-2008)，HepG2-NTCP細胞接種到24孔板中，接種2×105cells/well，過夜或細胞貼壁；細胞分為實驗組和對照組。實驗組為ayw血清型病毒1.0×107(MOI=500)和梯度稀釋后的，從1.2.5中篩選出的廣譜性抗體(0.72、0.36、0.18、0.09、0.045 mg/ml)共孵育，對照組(MOCK組)為病毒和PBS共孵育。各組在DMEM(10%FBS、2.5%DMSO、4%PEG8000)中混勻后感染細胞過夜；用PBS洗5次，之后每2 d換一次培養(yǎng)基，并檢測第5天培養(yǎng)基中HBeAg。具體方法見說明書。

2 結果

2.1從S蛋白抗體陽性的健康獻血者外周血中制備針對乙肝病毒S蛋白的抗體 利用Ficoll從外周血中分離出PBMC，經(jīng)過染色后，我們使用流式分選儀，分選出CD19-FITC、IgG-APC、biotin-S-PE全部為陽性的細胞，即可以結合S蛋白的特異性記憶B細胞。其中1號和2號血液中可以結合S蛋白的記憶B細胞占記憶B細胞總數(shù)的比例分別為0.93%(圖1A)和2.90%(圖1B)。按照1.2.3中描述的方法，獲得單克隆抗體的表達載體。將構建正確的重、輕鏈表達載體共轉染至24孔板的CHO細胞中進行小規(guī)模表達，利用ELISA法檢測上清抗體濃度，定量后檢測抗體的特異性結合能力，選取結合活性強的進行大規(guī)模純化。

2.2抗體結合活性檢測 采用間接ELISA檢測獲得抗體的結合活性，共獲得出4株具有結合活性的抗體，1F2、1G4、2A1及2H2。利用CHO細胞大規(guī)模表達純化后，通過三種HBV病毒亞型的S蛋白來進行廣譜結合活性檢測。如圖2所示，相對于ayw,adr血清型的S蛋白，1F2、1G4、2A1抗體對adw血清型的S蛋白結合活性最好，2H2抗體對三種血清型的S蛋白結合活性差別較?。?1F2、2A1、2H2對三種血清型的病毒的S蛋白都有結合，1G4抗體只能與adw血清型的S蛋白結合，因此選擇1F2、2A1、2H2三株抗體做進一步的研究。對1F2、2A1、2H2三株抗體的族譜信息進行分析，如表1所示，三株抗體重、輕鏈族譜信息均不相同。

2.3抗體中和乙肝病毒能力的檢測 為了檢測單克隆抗體中和病毒的能力，我們利用 HepG2-NTCP[10]細胞系和KHB乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒檢測HBeAg的指標。如圖3所示，與對照組相比，實驗組中的三株抗體共孵育的細胞在第5天時，HBeAg均有明顯下降，這說明三株抗體對HBV病毒均有中和作用。較2A1來說，1F2，2H2兩個抗體中和乙肝病毒的能力較強。隨著孵育抗體濃度的下降，HBeAg的量不斷上升，表明抗體中和病毒的能力不斷減弱，說明三株抗體對HBV病毒的中和效果具有劑量依賴效應。

2.4抗原構象對抗體結合活性的影響 為了探究抗體的結合方式，我們將S蛋白變性后包被至ELISA板上來檢測抗體的結合活性[11]。如圖4A所示，相對于天然狀態(tài)下的S蛋白，1F2和2A1兩個抗體均有減弱，其中1F2抗體的結合活性下降幅度最大；2H2抗體的結合活性幾乎沒有下降。這說明1F2，2H2抗體結合依賴于S蛋白的空間構象結構，2A1抗體結合S蛋白依賴于連續(xù)的氨基酸序列。

圖1 流式分選出可以特異結合S蛋白的記憶B細胞Fig.1 Isolation of S-specific memory B cells by flow sorting

圖2 四株HBV抗體對三種HBV血清型S蛋白結合活性檢測Fig.2 Specific binding to S protein of three HBV serotypesNote:Control.3E1,A monoclonal human antibody against Influenza A virus.

圖3 抗體對乙肝病毒中和活性的檢測Fig.3 Neutralizing activity of three HBV antibodiesNote:MOCK.antibody-,virus+.

表1抗體重輕鏈Germline信息

Tab.1Germlineinformationofthreeantibodiesheavyandlightchain

mAbVHTopVgenematchTopDgenematchTopJgenematchVLTopVgenematchTopJgenematchChaintype1F2IGHV3?15?01IGHD3?3?01IGHJ5?02IGKV2?29?02IGKJ2?01Vκ2A1IGHV3?21?01IGHD3?3?01IGHJ4?02IGKV3?20?01IGKJ2?01Vκ2H2IGHV4?34?01IGHD3?10?02IGHJ6?03IGKV3?15?01IGKJ4?01Vκ

表2合成多肽信息

Tab.2Aminoacidsequencesofeachsynthesizedpeptides

a aSequenceStructurePL1104?120NH2?LPVCPLIPGSSTTSTGP?K?biotin?CONH2linerPL2149?163NH2?CIPIPSSWAFAKYLW?K?biotin?CONH2linerPC1122?137NH2?KTCTTPAQGNSMFPSC?K?biotin?CONH2cyclizedPC2139?148NH2?CTKPTAGNCT?K?biotin?CONH2cyclized

圖4 ELISA法探究抗體結合抗原表位信息Fig.4 Epitope mapping with ELISA

2.5抗體結合抗原表位信息的鑒定 為了探究抗體結合S蛋白詳細的表位信息，我們合成adw血清型乙肝病毒S蛋白兩個線性位置PL1，PL2以及兩個環(huán)形的位置PC1，PC2(表2)的肽段[12]，利用間接ELISA方法來檢測抗體是否可以和這四個肽段的某一段或者某幾段結合。如圖4B所示，1F2，2H2兩個抗體主要識別PC1(122-137)段，即S蛋白的第一個環(huán)形區(qū)域。2A1抗體和4個肽段都不結合，這表明2A1的結合有可能依賴于其他沒有被報道過的表位。

3 討論

乙肝免疫球蛋白自問世以來，在乙肝病毒的防御上發(fā)揮了至關重要的作用。因為S蛋白中具有一個位于氨基酸124-147之間的“a”決定簇，存在于任何一種血清亞型中，針對此位點產生的抗體可以防止所有亞型的乙肝病毒感染，在疫苗研究和免疫學檢測中都具有重要意義[13]，所以現(xiàn)有市場中的HBIG都是針對乙肝病毒S蛋白的免疫球蛋白。相對于通過血液提純的免疫球蛋白，單克隆抗體由于其成分單一，靶點清晰，往往表現(xiàn)出靈敏度更高，特異性更強的效果。

抗體的特異性結合能力和中和病毒的能力是評價中和抗體的關鍵指標。中和抗體通過多種方式發(fā)揮中和病毒的作用，包括通過與抗原蛋白的結合，阻斷病毒與宿主細胞結合；通過抑制抗原蛋白或者病毒顆粒的釋放[4]；發(fā)揮ADCC和CDC效應，通過人體自身免疫系統(tǒng)起到中和病毒的作用[14]。已報道的乙肝全人抗體中，大部分都是通過與抗原蛋白的結合發(fā)揮作用，但也有報道抗體的特異性結合能力與中和能力并沒有直接對應的正相關關系[15]。本研究通過流式分選，單細胞RT-PCR以及間接ELISA技術共篩選出3株可以結合三種乙肝病毒血清型 (adw,ayw,adr)S蛋白的抗體，其中，1F2和2H2對乙肝病毒具有明顯的中和效果。通過對抗體表征的探究，發(fā)現(xiàn)1F2和2A1抗體結合依賴于抗原的空間構象，2H2抗體的結合依賴于連續(xù)的氨基酸序列。1F2和2H2結合S蛋白的位置為S蛋白胞外區(qū)第一個環(huán)狀區(qū)域，2A1抗體不與任何一個肽段結合。相對于2A1抗體，1F2和2H2抗體具有較好的中和病毒。這表明，具有較好中和活性的抗體更傾向于結合S蛋白胞外區(qū)的第一個環(huán)狀區(qū)，這與前人的報道類似[16]。本研究利用三種血清型乙肝病毒S蛋白,證明了抗體的廣譜性，進一步驗證了不同血清亞型乙肝病毒S蛋白序列中，存在與抗體結合中起關鍵作用的相對保守的序列；通過對抗體表位信息和中和效果的探究，闡明了抗體的結合位置與其中和效果具有一定的對應關系。這些研究成果不僅為正常人暴露于乙肝病毒后的緊急治療，阻斷母嬰傳播及乙型肝炎表面抗原陽性患者肝移植后乙肝的復發(fā)提供預防和治療手段，并為乙肝疫苗的設計提供了新思路。