佀傳亞 潘少坤 凌志洋 伊春艷 鄧志瑞 謝幼華 孫 兵

(上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444)

乙型肝炎是一種由乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的急、慢性肝部炎癥，全球大約有1/3的人口感染乙肝病毒，中國(guó)是感染乙肝病毒人口密度較大的國(guó)家[1]。對(duì)于乙肝病毒，干擾素和核苷類藥物，如恩替卡韋、富馬酸替諾福韋酯是主要的治療手段[2]。但是傳統(tǒng)的治療方案周期長(zhǎng)，且容易因?yàn)椴《井a(chǎn)生的基因突變而使機(jī)體產(chǎn)生抗藥性[3]，所以國(guó)內(nèi)外的研究者也在探究利用免疫的方法治療乙肝[4]。預(yù)防方面，利用基因工程重組表達(dá)的乙肝疫苗和血源來(lái)源的乙肝免疫球蛋白(Hepatitis B hyper-immune globulin ，HBIG)起著重要的作用。HBIG是一種從人的血清或者血漿中分離出來(lái)的針對(duì)乙肝病毒表面抗原S蛋白的免疫球蛋白。由于其針對(duì)乙肝病毒具有很好的阻斷作用，所以廣泛應(yīng)用于乙肝病毒暴露后的預(yù)防，阻斷母嬰傳播以及對(duì)乙肝表面抗原陽(yáng)性患者肝移植后的乙肝復(fù)發(fā)的預(yù)防上。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HBIG能通過阻斷乙肝病毒 S蛋白與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合，進(jìn)而抑制病毒顆粒感染宿主細(xì)胞；或通過抑制S蛋白以及病毒顆粒從細(xì)胞內(nèi)釋放[5]，達(dá)到阻斷病毒感染的目的。傳統(tǒng)制備HBIG的方法都是從正常人的血液中篩選出高效價(jià)的血漿，經(jīng)低溫乙醇法提純而獲得。這種獲得的方式雖然十分有效，但是具有以下幾個(gè)弊端：①獲得好的免疫球蛋白特別依賴于高效價(jià)的血漿，質(zhì)控較復(fù)雜。②免疫球蛋白為血液制品，直接來(lái)源于人血，具有潛在的血源性疾病傳染的風(fēng)險(xiǎn)[6]。相對(duì)于通過血液直接分離的抗體，非血清來(lái)源的全人單克隆抗體可能更安全并且展現(xiàn)出更好的效果[7]。本研究利用流式分選和單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)獲得三株全人單克隆抗體[8]。并通過對(duì)抗體結(jié)合，抗原表位以及中和病毒能力的探究，為正常人暴露于乙肝病毒后的緊急治療、阻斷母嬰傳播，肝臟移植后乙肝表面抗原陽(yáng)性患者的乙肝復(fù)發(fā)提供預(yù)防手段，并為預(yù)防性乙肝疫苗的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 生物素化試劑購(gòu)自Thermo scientific公司；AriaⅡ流式分選儀；FITC Mouse Anti-Human CD19、APC Mouse Anti-Human IgG購(gòu)自BD Bioscience；Streptavidin PE 購(gòu)自Biolegend；Super-ScriptTMIII First-Stand Synthesis System for RT-PCR(Cat:18080-051)購(gòu)自Invitrogen；S(adw，ayw，adr型)蛋白購(gòu)自Prospec公司；普通DNA離心柱型PCR產(chǎn)物純化試劑盒，離心柱型質(zhì)粒小提試劑盒，離心柱型普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自北京Transgen生物技術(shù)有限公司；Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)Antibody，Goat Anti-Human IgG(Fc Specific)-Peroxidase antibody，Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)-Peroxidase antibody購(gòu)自Sigma；多肽合成自上海科肽生物科技有限公司；ELISA板采購(gòu)自Thermo scientific公司；ExpiCHO-STM細(xì)胞購(gòu)自Thermo scientific公司；HepG2-NTCP細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自己構(gòu)建； KHB乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司。

1.2方法

1.2.1抗原蛋白生物素化 根據(jù)說明書配置10 mmol/L 的Biotin Reagent并按照每mol蛋白對(duì)應(yīng)20 mol Biotin計(jì)算0.05 mg的S蛋白需要的Biotin Reagent的量。混合均勻避光，置于冰上2 h。再利用脫鹽柱洗去多余的Biotin Reagent。

1.2.2流式分選特異針對(duì)S蛋白的記憶B細(xì)胞 單個(gè)B細(xì)胞的獲得主要利用RT-PCR技術(shù)。利用Ficoll從健康獻(xiàn)血者血清中分離出PBMC細(xì)胞，并利用FITC標(biāo)記CD19,APC標(biāo)記IgG,PE標(biāo)記1.2.1中生物素化后的S蛋白。用流式細(xì)胞儀分選出三陽(yáng)性的單細(xì)胞，并利用96孔板進(jìn)行收集，每孔一個(gè)記憶B細(xì)胞。

1.2.3抗體表達(dá)載體的構(gòu)建以及抗體的表達(dá) 利用反轉(zhuǎn)試劑對(duì)1.2.2中篩選出的單個(gè)特異性的記憶B細(xì)胞進(jìn)行反轉(zhuǎn)獲得每個(gè)細(xì)胞的總cDNA，利用人抗體恒定區(qū)序列設(shè)計(jì)引物通過巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增[9]。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳，選擇其中可以同時(shí)出現(xiàn)重輕鏈的樣品進(jìn)行割膠回收進(jìn)行測(cè)序，利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/網(wǎng)站來(lái)選擇出測(cè)序結(jié)果顯示為完整抗體的樣品，根據(jù)抗體基因的族譜信息，分別構(gòu)建到對(duì)應(yīng)的,帶有人類抗體恒定區(qū)IgG1基因的IgH、Igκ和Igλ載體中。構(gòu)建成功的重輕鏈表達(dá)載體利用ExpiFectamineTM轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至ExpiCHO-STM 細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。8 d后收集細(xì)胞上清并利用Protein G進(jìn)行純化。

1.2.4細(xì)胞上清濃度測(cè)定 利用coating buffer將Goat Anti-Human IgG(Fab Specific)Antibody包被至ELISA板中，濃度為5 μg/ml,每孔100 μl，4℃過夜，PBST洗3次后利用2%的BSA進(jìn)行封閉，每孔200 μl，37℃ 2 h。PBST再次洗3次后加入標(biāo)準(zhǔn)品(human IgG)和待測(cè)樣品，每孔100 μl。其中標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋，濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0 ng/ml，待測(cè)樣品按照80、400、2 000、10 000倍進(jìn)行稀釋。37℃孵育2 h后PBST洗板3次，加入Goat Anti-Human IgG(Fc-specific)Antibody 進(jìn)行孵育(1∶8 000)，每孔100 μl，常溫避光1 h，PBST洗板3次后，利用TMB顯色液顯色，每孔100 μl,利用1 mol HCl作為終止液，每孔50 μl。450 nm吸光度測(cè)定吸光值。

1.2.5抗體結(jié)合能力測(cè)定 購(gòu)買的S蛋白利用coating buffer 包被至ELISA板中，濃度為5 μg/ml,每孔100 μl，4℃過夜。PBST 3次后利用2%的BSA進(jìn)行封閉，每孔200 μl ，37℃2 h。PBST再次洗3次后加入待測(cè)抗體，濃度為5 μg/ml ，每孔100 μl。37℃孵育2 h后PBST洗板3次，加入Goat Anti-human IgG(Fc-specific)Antibody 進(jìn)行孵育(1∶8 000)，每孔100 μl，常溫1 h。PBST洗板3次后，利用TMB顯色液顯色，每孔100 μl,利用1 mol HCl作為終止液，每孔50 μl。450 nm吸光度測(cè)定吸光值。

1.2.6變性ELISA 將自然狀態(tài)下的S蛋白溶液與終濃度分別為0.1%十二烷基硫酸鈉和50 mmol/L 二硫蘇糖醇混合均勻，100℃5 min，進(jìn)行蛋白變性。利用coating buffer包被至ELISA板中，同時(shí)包被自然狀態(tài)下的S蛋白作為對(duì)照,4℃過夜，其他步驟同1.2.5。

1.2.7多肽結(jié)合試驗(yàn) 每條肽段利用coating buffer稀釋包被至ELISA板中，濃度為100 μg/ml,每孔100 μl，4℃過夜，其他步驟同1.2.5。

1.2.8病毒中和試驗(yàn) HBeAg的檢測(cè)利用KHB乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒(YZB/國(guó) 0770-2008)，HepG2-NTCP細(xì)胞接種到24孔板中，接種2×105cells/well，過夜或細(xì)胞貼壁；細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為ayw血清型病毒1.0×107(MOI=500)和梯度稀釋后的，從1.2.5中篩選出的廣譜性抗體(0.72、0.36、0.18、0.09、0.045 mg/ml)共孵育，對(duì)照組(MOCK組)為病毒和PBS共孵育。各組在DMEM(10%FBS、2.5%DMSO、4%PEG8000)中混勻后感染細(xì)胞過夜；用PBS洗5次，之后每2 d換一次培養(yǎng)基，并檢測(cè)第5天培養(yǎng)基中HBeAg。具體方法見說明書。

2 結(jié)果

2.1從S蛋白抗體陽(yáng)性的健康獻(xiàn)血者外周血中制備針對(duì)乙肝病毒S蛋白的抗體 利用Ficoll從外周血中分離出PBMC，經(jīng)過染色后，我們使用流式分選儀，分選出CD19-FITC、IgG-APC、biotin-S-PE全部為陽(yáng)性的細(xì)胞，即可以結(jié)合S蛋白的特異性記憶B細(xì)胞。其中1號(hào)和2號(hào)血液中可以結(jié)合S蛋白的記憶B細(xì)胞占記憶B細(xì)胞總數(shù)的比例分別為0.93%(圖1A)和2.90%(圖1B)。按照1.2.3中描述的方法，獲得單克隆抗體的表達(dá)載體。將構(gòu)建正確的重、輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至24孔板的CHO細(xì)胞中進(jìn)行小規(guī)模表達(dá)，利用ELISA法檢測(cè)上清抗體濃度，定量后檢測(cè)抗體的特異性結(jié)合能力，選取結(jié)合活性強(qiáng)的進(jìn)行大規(guī)模純化。

2.2抗體結(jié)合活性檢測(cè) 采用間接ELISA檢測(cè)獲得抗體的結(jié)合活性，共獲得出4株具有結(jié)合活性的抗體，1F2、1G4、2A1及2H2。利用CHO細(xì)胞大規(guī)模表達(dá)純化后，通過三種HBV病毒亞型的S蛋白來(lái)進(jìn)行廣譜結(jié)合活性檢測(cè)。如圖2所示，相對(duì)于ayw,adr血清型的S蛋白，1F2、1G4、2A1抗體對(duì)adw血清型的S蛋白結(jié)合活性最好，2H2抗體對(duì)三種血清型的S蛋白結(jié)合活性差別較小； 1F2、2A1、2H2對(duì)三種血清型的病毒的S蛋白都有結(jié)合，1G4抗體只能與adw血清型的S蛋白結(jié)合，因此選擇1F2、2A1、2H2三株抗體做進(jìn)一步的研究。對(duì)1F2、2A1、2H2三株抗體的族譜信息進(jìn)行分析，如表1所示，三株抗體重、輕鏈族譜信息均不相同。

2.3抗體中和乙肝病毒能力的檢測(cè) 為了檢測(cè)單克隆抗體中和病毒的能力，我們利用 HepG2-NTCP[10]細(xì)胞系和KHB乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒檢測(cè)HBeAg的指標(biāo)。如圖3所示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中的三株抗體共孵育的細(xì)胞在第5天時(shí)，HBeAg均有明顯下降，這說明三株抗體對(duì)HBV病毒均有中和作用。較2A1來(lái)說，1F2，2H2兩個(gè)抗體中和乙肝病毒的能力較強(qiáng)。隨著孵育抗體濃度的下降，HBeAg的量不斷上升，表明抗體中和病毒的能力不斷減弱，說明三株抗體對(duì)HBV病毒的中和效果具有劑量依賴效應(yīng)。

2.4抗原構(gòu)象對(duì)抗體結(jié)合活性的影響 為了探究抗體的結(jié)合方式，我們將S蛋白變性后包被至ELISA板上來(lái)檢測(cè)抗體的結(jié)合活性[11]。如圖4A所示，相對(duì)于天然狀態(tài)下的S蛋白，1F2和2A1兩個(gè)抗體均有減弱，其中1F2抗體的結(jié)合活性下降幅度最大；2H2抗體的結(jié)合活性幾乎沒有下降。這說明1F2，2H2抗體結(jié)合依賴于S蛋白的空間構(gòu)象結(jié)構(gòu)，2A1抗體結(jié)合S蛋白依賴于連續(xù)的氨基酸序列。

圖1 流式分選出可以特異結(jié)合S蛋白的記憶B細(xì)胞Fig.1 Isolation of S-specific memory B cells by flow sorting

圖2 四株HBV抗體對(duì)三種HBV血清型S蛋白結(jié)合活性檢測(cè)Fig.2 Specific binding to S protein of three HBV serotypesNote:Control.3E1,A monoclonal human antibody against Influenza A virus.

圖3 抗體對(duì)乙肝病毒中和活性的檢測(cè)Fig.3 Neutralizing activity of three HBV antibodiesNote:MOCK.antibody-,virus+.

表1抗體重輕鏈Germline信息

Tab.1Germlineinformationofthreeantibodiesheavyandlightchain

mAbVHTopVgenematchTopDgenematchTopJgenematchVLTopVgenematchTopJgenematchChaintype1F2IGHV3?15?01IGHD3?3?01IGHJ5?02IGKV2?29?02IGKJ2?01Vκ2A1IGHV3?21?01IGHD3?3?01IGHJ4?02IGKV3?20?01IGKJ2?01Vκ2H2IGHV4?34?01IGHD3?10?02IGHJ6?03IGKV3?15?01IGKJ4?01Vκ

表2合成多肽信息

Tab.2Aminoacidsequencesofeachsynthesizedpeptides

a aSequenceStructurePL1104?120NH2?LPVCPLIPGSSTTSTGP?K?biotin?CONH2linerPL2149?163NH2?CIPIPSSWAFAKYLW?K?biotin?CONH2linerPC1122?137NH2?KTCTTPAQGNSMFPSC?K?biotin?CONH2cyclizedPC2139?148NH2?CTKPTAGNCT?K?biotin?CONH2cyclized

圖4 ELISA法探究抗體結(jié)合抗原表位信息Fig.4 Epitope mapping with ELISA

2.5抗體結(jié)合抗原表位信息的鑒定 為了探究抗體結(jié)合S蛋白詳細(xì)的表位信息，我們合成adw血清型乙肝病毒S蛋白兩個(gè)線性位置PL1，PL2以及兩個(gè)環(huán)形的位置PC1，PC2(表2)的肽段[12]，利用間接ELISA方法來(lái)檢測(cè)抗體是否可以和這四個(gè)肽段的某一段或者某幾段結(jié)合。如圖4B所示，1F2，2H2兩個(gè)抗體主要識(shí)別PC1(122-137)段，即S蛋白的第一個(gè)環(huán)形區(qū)域。2A1抗體和4個(gè)肽段都不結(jié)合，這表明2A1的結(jié)合有可能依賴于其他沒有被報(bào)道過的表位。

3 討論

乙肝免疫球蛋白自問世以來(lái)，在乙肝病毒的防御上發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因?yàn)镾蛋白中具有一個(gè)位于氨基酸124-147之間的“a”決定簇，存在于任何一種血清亞型中，針對(duì)此位點(diǎn)產(chǎn)生的抗體可以防止所有亞型的乙肝病毒感染，在疫苗研究和免疫學(xué)檢測(cè)中都具有重要意義[13]，所以現(xiàn)有市場(chǎng)中的HBIG都是針對(duì)乙肝病毒S蛋白的免疫球蛋白。相對(duì)于通過血液提純的免疫球蛋白，單克隆抗體由于其成分單一，靶點(diǎn)清晰，往往表現(xiàn)出靈敏度更高，特異性更強(qiáng)的效果。

抗體的特異性結(jié)合能力和中和病毒的能力是評(píng)價(jià)中和抗體的關(guān)鍵指標(biāo)。中和抗體通過多種方式發(fā)揮中和病毒的作用，包括通過與抗原蛋白的結(jié)合，阻斷病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合；通過抑制抗原蛋白或者病毒顆粒的釋放[4]；發(fā)揮ADCC和CDC效應(yīng)，通過人體自身免疫系統(tǒng)起到中和病毒的作用[14]。已報(bào)道的乙肝全人抗體中，大部分都是通過與抗原蛋白的結(jié)合發(fā)揮作用，但也有報(bào)道抗體的特異性結(jié)合能力與中和能力并沒有直接對(duì)應(yīng)的正相關(guān)關(guān)系[15]。本研究通過流式分選，單細(xì)胞RT-PCR以及間接ELISA技術(shù)共篩選出3株可以結(jié)合三種乙肝病毒血清型 (adw,ayw,adr)S蛋白的抗體，其中，1F2和2H2對(duì)乙肝病毒具有明顯的中和效果。通過對(duì)抗體表征的探究，發(fā)現(xiàn)1F2和2A1抗體結(jié)合依賴于抗原的空間構(gòu)象，2H2抗體的結(jié)合依賴于連續(xù)的氨基酸序列。1F2和2H2結(jié)合S蛋白的位置為S蛋白胞外區(qū)第一個(gè)環(huán)狀區(qū)域，2A1抗體不與任何一個(gè)肽段結(jié)合。相對(duì)于2A1抗體，1F2和2H2抗體具有較好的中和病毒。這表明，具有較好中和活性的抗體更傾向于結(jié)合S蛋白胞外區(qū)的第一個(gè)環(huán)狀區(qū)，這與前人的報(bào)道類似[16]。本研究利用三種血清型乙肝病毒S蛋白,證明了抗體的廣譜性，進(jìn)一步驗(yàn)證了不同血清亞型乙肝病毒S蛋白序列中，存在與抗體結(jié)合中起關(guān)鍵作用的相對(duì)保守的序列；通過對(duì)抗體表位信息和中和效果的探究，闡明了抗體的結(jié)合位置與其中和效果具有一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這些研究成果不僅為正常人暴露于乙肝病毒后的緊急治療，阻斷母嬰傳播及乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性患者肝移植后乙肝的復(fù)發(fā)提供預(yù)防和治療手段，并為乙肝疫苗的設(shè)計(jì)提供了新思路。